Vereinfachte hydrodynamische 3D-Strömungsfokussierung für das Labor

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14671 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die genaue Kontrolle der Position einer Flüssigkeit und eines Partikels innerhalb der Lab-on-a-Chip-Plattform ist eine entscheidende Voraussetzung für viele nachgelagerte Analyseprozesse, wie z. B. Detektion, Einfang und Trennung, wobei die Erfassung auf Einzelpartikelebene erfolgt. Mit der Entwicklung der mikrofluidischen Fertigungstechnologie hat sich die Fokussierung von Partikeln/Zellen von zwei auf drei Dimensionen verlagert. Die hydrodynamische 3D-Fokussierung, die die ankommende Partikelwolke sortiert und ausrichtet, sodass sie einzeln den Abfragebereich passieren, ermöglicht neue Möglichkeiten und Durchbrüche im Einzelzellanalysesystem. Trotz der in der Literatur gezeigten hervorragenden Ergebnisse fehlt es immer noch an einem Gerät, das gleichzeitig die Anforderungen an hohen Durchsatz, Kompaktheit, hohe Integrierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit erfüllt und sich zu einem weithin akzeptierten Arbeitszentrum für biomedizinische Forschung und klinische Anwendungen entwickelt. Hier haben wir ein einzigartiges 3D-Mikrofluidikgerät mit Flussfokussierung vorgeschlagen, das in einem Quarzglassubstrat vergraben ist und möglicherweise alle diese Vorteile vereint. Durch die Gestaltung eines Probenkanals, der in einem größeren Pufferkanal aufgehängt ist und mithilfe der laserunterstützten Mikromaschinentechnik hergestellt wird, wird eine nicht größenabhängige Fokussierungsfähigkeit gezeigt. Mit hoher Genauigkeit wurde ein räumlich und zeitlich stabiler zentraler Fluss einer Mischung aus 15 μm und 6 μm PS-Partikeln zu einer 1 μm PS-Mikrokügelchenlösung erhalten. Um die erreichbare Fokussierungsauflösung zu testen, wurde der Chip abschließend auf den Nachweis von Escherichia coli-Bakterien in Wasserlösung als Konzeptnachweis für die biologische Anwendung getestet.

Die präzise Manipulation von Flüssigkeiten an Bord mikrofluidischer Plattformen hat in den letzten Jahren aufgrund des breiten Anwendungsspektrums, das umgesetzt werden kann, die Aufmerksamkeit des Lab-On-a-Chip (LOC)-Forschungsgebiets geweckt. Neben der drastischen Reduzierung der Menge der zu verarbeitenden Proben und der Verkleinerung der Instrumente auf einen tragbaren Maßstab hat die Fähigkeit, die Position einer Flüssigkeit – und damit auch der darin fließenden Partikel – innerhalb mikrofluidischer Geräte genau zu steuern, die Sensorik verändert die Einzelpartikelebene. Dadurch werden die Empfindlichkeit und die Menge der extrahierbaren Informationen erheblich verbessert. Mehrere Bereiche haben bereits von diesen Vorteilen profitiert, beispielsweise der biomedizinische Bereich – z. B. Durchflusszytometrie und Einzelpartikelerkennung1 – oder der Umweltbereich – z. B. Überwachung des Klimawandels, mikrobielle Wasserverschmutzung2 – und die Industrie – Kosmetik3 sowie die Reinheit von Lebensmitteln und Getränken Kontrolle2. Partikel, die innerhalb einer Mikrofluidikplattform strömen, insbesondere bei hohen Konzentrationen, verteilen sich zufällig im Querschnitt des Kanals, was die Effizienz jedes weiteren Analyseschritts drastisch beeinträchtigt4. Das Hauptprinzip der 3D-Flussfokussierung besteht also darin, die einfallende Partikelwolke zu ordnen und sie so auszurichten, dass sie den Abfragebereich einzeln durchqueren. Daher sollte aus dieser Perspektive das ideale Fokussiergerät das Vorhandensein eines oder mehrerer nachgeschalteter Analyseschritte (z. B. Detektion, Einfang und Trennung) berücksichtigen und gleichzeitig in der Lage sein, sehr kleine Partikel und sogar Moleküle zu verwalten, die nicht größenabhängig sind Die Fokussierfähigkeit ist ein Game-Changer. Aus diesem Grund müssen folgende kritische Anforderungen erfüllt werden: Kompaktheit, um die Portabilität der Plattform nicht zu beeinträchtigen, hoher Durchsatz, um den gesamten Analyseprozess nicht zu verlangsamen, und Benutzerfreundlichkeit, um das Gerät so automatisiert und flexibel wie möglich zu machen . Viele verschiedene Strategien haben bereits versucht, dieser Herausforderung zu begegnen. Hauptsächlich lassen sich zwei unterschiedliche Ansätze identifizieren: Methoden, die Kräfte auf Partikel von außen (auch bekannt als aktiv) oder intern (auch bekannt als passiv) induzieren. Im ersten Fall sind die am häufigsten verwendeten Kraftfelder akustische5, 6, magnetische7 und elektrische8, 9. Obwohl es sich um wirksame Methoden handelt, erschwert die Notwendigkeit weiterer externer Reize den Herstellungsprozess und erfordert die Integration von Elementen wie Piezowandlern und Magneten , und Elektroden sowie der Betrieb, der neben der Strömung auch die Steuerung der Krafterzeugung erfordert. Damit das Feld dann auf die Flugbahn der Partikel einwirken kann, müssen die Flussraten begrenzt werden, was zu Durchsätzen von 0,85 µL/min bis zu einigen hundert µL/min und nur in begrenzten Fällen um 500 µL/min führt4, 6. Auf der Andererseits üben passive Methoden allein aufgrund ihrer Strömungskonfiguration eine fokussierende Wirkung aus. In diesem Fall kann eine weitere Unterscheidung getroffen werden: Einige Ansätze nutzen hüllenlose Effekte aufgrund von Trägheitskräften, die durch die Kanalgeometrie10 oder durch die Integration von Strukturen wie Rillen oder Säulen im Kanal11, 12 erzeugt werden, während andere mehrere Einlässe verwenden , von 1 bis 4, um den Probenfluss zu begrenzen13,14,15,16. Trägheitsmikrofluidik ist eine attraktive Methode, da sie hohe Durchsätze (bis zu einigen ml/min)17 ermöglicht und keine Hüllströme erforderlich sind, wodurch die betriebliche Komplexität verringert wird. Allerdings ist es mit der Trägheitsfokussierung schwierig, die Fokussierungsauflösung zu verbessern, insbesondere auf kleinem Raum. Tatsächlich ist bekannt, dass diese Geräte den Wettbewerb zwischen zwei auf die strömenden Partikel wirkenden Kräften ausnutzen, die stark mit ihrer Größe zusammenhängen: den durch Scherung induzierten Auftriebskräften und den durch die Wand induzierten Auftriebskräften17. Um eine Strömungsfokussierung zu erreichen, ist es daher erforderlich, jeweils nur einen Partikeldurchmesser zu verwenden. Darüber hinaus stößt die Fokussierung von Partikeln im (Sub-)Mikrometerbereich auf Schwierigkeiten, da die für eine effektive Fokussierung erforderliche Mindestlänge des Mikrokanals mit abnehmender Partikelgröße dramatisch zunimmt, was sich auf die Kompaktheit des Chips auswirkt und die Integration weiterer Analyseschritte erschwert. Bei geraden Kanälen variieren die Geometrie und die Fokussierungslänge je nach Partikeldurchmesser10, 18, 19, 20, 21, während bei Spiralkanälen22, 23 oder Kontraktions-Expansions-Anordnungen24 durch die Verwendung einer Mischung unterschiedlicher Größen ein unterschiedliches Gleichgewicht entsteht Punkte werden an unterschiedlichen Positionen im Kanalabschnitt gesetzt. Dies führt zu mehreren fokussierten Flüssen, die für eine einzelne Abfrageregion ungeeignet sind. Dann treten Trägheitseffekte auf, wenn der Volumenanteil der Partikel weniger als 1 % beträgt – um zu vermeiden, dass Partikel-Partikel-Wechselwirkungen die Fokussierung stören25. Dies bedeutet, dass die Probe verdünnt werden muss, was den effektiven Durchsatz verringert und einen zusätzlichen Vorverarbeitungsschritt erfordert. Der konzeptionell einfachste Weg, den Probenfluss unabhängig von der Partikelgröße auf die Mitte eines Mikrofluidikkanals zu beschränken, besteht darin, weitere vier Flüsse in denselben Kanal zu injizieren. Viele Arbeiten haben eine solche Strategie umgesetzt und gute Fokussierungsergebnisse erzielt14, 16, 26, 27, aber die Notwendigkeit, fünf (oder sechs) Einlässe gleichzeitig zu verwalten, erleichtert den Einsatz des Geräts in klinischen Anwendungen immer noch nicht. Aus diesem Grund haben mehrere Gruppen interessante Lösungen vorgestellt, um die Anzahl der Einspritzöffnungen zu reduzieren. Eine der am häufigsten verwendeten Strategien besteht darin, einen ursprünglichen Zweig zu teilen, bevor er mit dem Hauptkanal verbunden wird, wodurch die Anzahl der Einlässe auf zwei reduziert wird13, 28, 29. Neben der geringeren Komplexität beim Betrieb solcher Geräte muss der Fluss präzise aufgeteilt werden alle Zweige, um eine genaue Partikelpositionierung zu erreichen. Somit steigt das Risiko, dass Asymmetrien in die Fluidmanipulation oder in die Geometrie, während der Herstellungsprozesse oder in die experimentelle Funktionsweise – z. B. aufgrund einer Luftblase – eintreten. Tripathi et al.30 haben eine vereinfachte Geometrie mit nur zwei Einlässen und ohne Aufteilung erreicht, die die Kombination einer Pufferströmung und des Dean-Wirbeleffekts aufgrund gekrümmter Kanäle nutzt. Neben der guten Fokussierungseffizienz sind die Durchsätze auf 100 µL/min begrenzt. Stattdessen haben einige andere Arbeiten einen Kompromiss gefunden, indem sie zwei Hülleneinlässe verwendet und das Seitenverhältnis des Probenkanals reduziert haben, sodass der Pufferfluss den Hauptfluss an der Verbindungsstelle umhüllt31, 32. Allerdings weisen auch diese Geräte einen begrenzten Durchsatzbereich auf von µL/min bis 30 µL/min, hauptsächlich aufgrund der Verformbarkeit des Polydimethylsiloxans (PDMS), aus dem sie bestehen. Stattdessen haben Patel et al.33 eine ähnliche Strategie verwendet, ihre Gerätedurchflussrate ist jedoch dank der Mikromahlung von Polymethylmethacrylat (PMMA) nicht begrenzt. Da ihre fokussierten Partikel jedoch am Boden des Hauptkanals fließen, besteht die Gefahr einer Verstopfung des Geräts. Andere kreative Lösungen stellen Versuche dar, einen Hauptkanal durch Puffereinlässe zu umgeben, indem zwei Mikropipetten34, mehrere Mikrokapillaren35 oder eine Mikrodüse36 integriert werden. Abgesehen von der eleganten Implementierung sind die Geräte sehr fragil und die Leistung hängt eng von der Genauigkeit des Herstellungsprozesses ab.

In dieser Arbeit stellen wir ein mikrofluidisches Netzwerk für die präzise Positionierung von Partikeln in der Mitte des Hauptkanals vor, das nur zwei Einlässe (Proben- und Mantelfluss) nutzt und darauf abzielt, die Anforderungen zu erfüllen – d. h. Benutzerfreundlichkeit, hohe Durchsätze und Kompaktheit – um die Plattformintegrierbarkeit voranzutreiben. Das Gerätedesign wird in numerischen Simulationen untersucht und dann dank der hohen Vielseitigkeit der Femtosekunden-Laserbestrahlung und der anschließenden chemischen Ätztechnik (FLICE) in Quarzglassubstrat eingebettet hergestellt37,38,39,40,41. Neben den großartigen 3D-Fähigkeiten bietet diese bekannte Technik auch die Möglichkeit, andere Analyseelemente – wie optische Elemente42, optische Fasern und Elektroden43 – zu integrieren, was den Weg für die Herstellung eines vollständig integrierten Mikro-Gesamtanalysesystems (μTAS) ebnet Bioanwendungen. Das hydrodynamische Fokussierungselement zeichnete sich dadurch aus, dass ankommende Mikrokügelchen aus Polystyrol (PS) unterschiedlicher Größe ausgerichtet wurden. Um die erreichbare Fokussierungsauflösung zu testen, wird anschließend ein Machbarkeitsnachweis erbracht, bei dem dieses Element zum optischen Nachweis des Vorhandenseins von Bakterien in einer Wasserprobe verwendet wird.

Um eine präzise hydrodynamische 3D-Fokussierung zu erreichen, ist das Vorhandensein einer begrenzenden Hüllströmung erforderlich. Aufgrund der Einschränkungen der aktuellen Herstellungstechniken für mikrofluidische Netzwerke besteht die einzige Möglichkeit, einen zentralen Fluss mit einer Pufferflüssigkeit zu verkleinern, darin, sie an einem bestimmten Punkt zusammenführen zu lassen, wodurch eine Verbindung mit mehreren Zweigen entsteht (Abb. 1a). Daher sind sowohl der Herstellungsprozess, der besondere Aufmerksamkeit erfordert, um keine Asymmetrien in die Geometrie einzuführen, als auch der Vorgang, der die Steuerung der anderen vier Flüsse erfordert, sehr komplex. Tatsächlich führt jedes Ungleichgewicht, das auf die Geometrie, eine unterschiedliche Strömungsviskosität oder die Verstopfung eines der Zweige zurückzuführen ist, entweder zu einer Fokussierungsstörung oder zu einer ungenauen Ausrichtung. Um dies zu vermeiden, haben wir eine einzigartige Geometrie entwickelt, die einen Probeneinlass in einem Pufferkanal (Abb. 1b) in einem nicht verformbaren Substrat (Quarzglas) umschließt. Durch die Ausnutzung der Möglichkeiten der FLICE-Fertigungstechnik war es möglich, den 3D-Probenkanal gut entlang der Achse des 3D-Hüllenkanals auszurichten (Abb. 1c, d), wodurch eine genaue Positionierung des fokussierten Flusses in der Mitte des Auslasses gewährleistet wurde . Auf diese Weise wird der Probenfluss dank der Laminarität auf natürliche Weise begrenzt, da ein einziger Pufferstrom erforderlich ist.

(a) Die am häufigsten verwendete Strategie zur Erzielung einer hydrodynamischen 3D-Fokussierung besteht darin, den zentralen Fluss auf vier Mantelflüsse zu beschränken. Dadurch erhöht sich die Komplexität sowohl des Herstellungsprozesses als auch des Betriebs solcher Geräte erheblich. (b) Die entworfene Geometrie weist nur zwei Einlasskanäle auf, einer in dem anderen verschachtelt. Auf diese Weise begrenzt der Pufferstrom den Probenfluss auf natürliche Weise in der Mitte des Auslasskanals und damit alle Partizipien unabhängig von ihrer Größe. (c) xy-Ebenenansicht des präsentierten Geräts. Der Probenkanal ist in der Mitte des Mantelkanals positioniert, sodass der austretende Fluss automatisch in der Mitte des Auslasses ausgerichtet wird. Dies gilt auch für die zx-Ebene (d).

Numerische Simulationen (COMSOL Multiphysics 5.3a) wurden durchgeführt, um die Strömungskonfiguration einer solchen Geometrie zu visualisieren und einige Optimierungen einzuführen. Um beispielsweise die Chip-Robustheit und die 3D-Symmetrie der verschiedenen Strömungen sicherzustellen, wurden die besten Ergebnisse mit der in Abb. 2 gezeigten Geometrie erzielt. Der Probenkanal mit einer scharfen Kurve wird an einem ungeätzten Quarzglasträger befestigt, der Folgendes enthält: es ist in Form eines „T“ modelliert. Um die Symmetrie sicherzustellen, wurde an der Verbindungsstelle der beiden Kanäle eine sphärische Erweiterung mit einem Radius von 200 μm hinzugefügt. Auf diese Weise kann sich die Flüssigkeit mit einer gleichmäßigeren Geschwindigkeitsverteilung (Abb. 2a) und einer engeren fokussierten Strömung (Abb. 2b) gleichmäßiger um das „T“-Hindernis herum neu anordnen. Für alle Simulationen wurde eine Hybridlösung für das Netz verwendet: grobes Netz in den am wenigsten interessanten Bereichen (z. B. die Verbindungsrohre), feines Netz für den 200-µm-Kanal und superfeines Netz für die gesamte Kugel und den hydrodynamischen Fokusbereich.

(a) Strömungsgeschwindigkeitskarte der Mikrofluidikkanäle in der xy- und zx-Ebene, erhalten mit Probeneingangsdrücken von 90 mbar und 190 mbar für den Hülleneinlass. Das Vorhandensein des Probenkanals wirkt als Hindernis, aber dank seiner „T“-Form und der sphärischen Ausdehnung führt das stromabwärtige Strömungsprofil zu einer gleichmäßigen Fluidgeschwindigkeitsverteilung sowohl in der xy- als auch in der zx-Ebene. (b) Die sphärische Vergrößerung verleiht dem Gerät außerdem ein stärkeres Fokussierungsverhalten, was zu einem schmaleren fokussierten Strahl führt.

Schließlich haben Simulationen auch gezeigt (Abb. 2b), wie es möglich ist, die Breite des begrenzten Strahls durch eine Verkleinerung der Abmessungen des Auslasskanals weiter zu verringern. Somit besteht die endgültige Geometrie, die hergestellt wurde, ausschließlich aus Kanälen mit rechteckigem Querschnitt, wobei der Puffereinlass einen Querschnitt von 200 μm × 200 μm, der Probeneinlass 50 μm × 50 μm und der Auslass 120 μm × 120 μm hat . Die Gesamtlänge der Kanäle beträgt nur 1,7 mm, was zu einem sehr kompakten Gerät führt.

Die vorgeschlagene Geometrie hat das Potenzial, eine vollständige hydrodynamische 3D-Fokussierung in einem einzigen Schreibschritt zu erreichen, was zu einem sehr kompakten und einfach zu bedienenden Gerät führt. Im Gegensatz zu anderen Mikrofabrikationstechnologien auf weichen Materialien ermöglichten die Fähigkeiten und die räumliche Auflösung der FLICE-Technik die schnelle und robuste Herstellung einer sehr komplexen Struktur (Abb. 3a). Der Probenkanal ist fast 500 µm lang in der Mitte des Pufferflusses aufgehängt. Dank der 30 µm dicken Wände, die direkt mit dem Schüttgut verbunden sind, hatten wir keine Probleme mit der Instabilität. Es ist kein Versiegelungs- oder Glühvorgang erforderlich, um mechanische Schwachstellen und Flüssigkeitslecks zu vermeiden. Um den fokussierten Fluss zu visualisieren, wurden Charakterisierungstests durchgeführt, indem entionisiertes Wasser in den Pufferkanal und eine blau gefärbte Lösung auf Wasserbasis injiziert wurde (Abb. 3b). Die Kanalbreite wurde mit einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (20-fach, NA 0,45) gemessen, um eine korrekte Auflösung (~ 1 µm) sicherzustellen.

(a) Stereomikroskopbild des Geräts mit eingesetztem und betriebsbereitem PEEK-Schlauch. (b) Optisches Mikroskopbild (5-fache Vergrößerung) des Geräts während der Strömungscharakterisierungsexperimente – Probeneingangseinlassdruck 80 mbar und Hülleneinlassdruck 110 mbar –. Die Kanalbreiten wurden auf einem anderen Bild (nicht gezeigt) gemessen, das mit einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (20×, NA 0,45, Auflösung ~ 1 µm) aufgenommen wurde. (c) Simulierter Querschnitt des hydrodynamischen Fokussierungszustands im Auslass (Pinlet-Probe = 80 mbar; Pinlet-Hülle = 110 mbar). Der äußerste rote Bereich (Bereich verstreuter roter Punkte) ist ein Artefakt der Simulation aufgrund der rutschfesten Bedingungen der Wände, während der 16 μm × 16 μm große blaue Bereich der Probenquerschnitt ist. (d) Experimenteller Querschnitt, erhalten als Funktion des Einlassmanteldrucks. Der Eingangsdruck wurde auf 80 mbar eingestellt, während der Puffereingangsdruck in 20-mbar-Schritten von 60 bis 160 mbar gescannt wurde. Die Ergebnisse für Fälle mit Pinlet-Hülle < 80 mbar werden nicht gezeigt, da aufgrund des ungünstigen Druckpaars keine Strömungsfokussierung beobachtet wurde. Der begrenzte Strom weist eine gute Symmetrie auf und der engste erreichte Wert beträgt 9 μm × 5 μm für die xy- bzw. zx-Ebene. Wie aus der Fallstudie hervorgeht (Abb. 3b und Punktdaten mit einem Sternchen), validierte der experimentelle Test die numerischen Simulationen, was zu einer ähnlichen Dimension und einem 3D-symmetrischen fokussierten Fluss führte.

Aufgrund der extremen Kompaktheit des Geräts – mit einer Gesamtlänge von 2 mm und einer Fokussierungsabschnittslänge von 0,62 mm – wurden keine Diffusionsmechanismen beobachtet und die vom Probeneinlass kommende Strömung wurde korrekt geschrumpft, sowohl in der Horizontalen als auch in der vertikale Richtung gleichmäßig und entspricht den durch die numerischen Simulationen erhaltenen Abmessungen (Abb. 3c, weitere Einzelheiten zu dieser Simulation finden Sie im Abschnitt „Material und Methode“). Die Beziehung zwischen der Probe und dem Eingangsdruck der Hülle wurde untersucht, indem für den ersten ein angemessener Druck (80 mbar) gewählt und dann der zweite in Schritten von 20 mbar variiert wurde (Abb. 3d). Wie erwartet ist keine Strömungsfokussierung zu beobachten, wenn der Hüllstrom mit einem Druck injiziert wird, der niedriger ist als der des Probeneinlasses. Stattdessen tritt bei Annäherung an denselben Wert ein leichter Fokussierungseffekt auf. Dies kann durch den Unterschied im Querschnitt der beiden Kanäle (Probeneinlass: 50 µm × 50 µm, Puffereinlass: 200 µm × 200 µm) erklärt werden, der es dem Mantelfluss ermöglicht, bei gleichem Injektionsdruck höhere Geschwindigkeiten zu erreichen . Dann entsteht ein Ungleichgewicht zwischen den beiden Drücken zugunsten des Hülseneinlasses, wodurch der Probenfluss zunehmend eingeschränkt wird. Da der Probenkanal entlang der Mantelkanalachse zentriert ist, liegt die Schrumpfung in der Mitte des Querschnitts des Auslasskanals. Durch Erhöhen des Manteldrucks um mehr als das Doppelte des Probeneinlasses verschwindet der fokussierte Strom, da die Pufferflüssigkeit am Auslass des Probenkanals eine virtuelle Wand erzeugt, die den eingehenden Fluss blockiert. Es ist zu erkennen, dass der fokussierte Fluss eine gute Symmetrie aufweist und ähnliche Größen sowohl in der xy-Ebene als auch in der zx-Ebene aufweist, mit Ausnahme der höchsten Unwucht, bei der die Abmessung in der xy-Ebene ~ 9 µm beträgt, während sie 5 µm beträgt µm in der anderen Ebene. Es sollte beachtet werden, dass das Gerät in der Lage ist, mit der Literatur vergleichbare Fokussierungswerte zu erreichen, jedoch mit viel weniger Komplexität sowohl im Herstellungsprozess als auch im Betrieb (nur zwei Einlasskanäle erforderlich). Dies legt nahe, dass das Fokussierungspotenzial dieser Geometrie sogar noch weiter gesteigert werden kann – beispielsweise durch eine Verringerung des Durchmessers des Probeneinlasses.

Da die Zielanwendung unseres Geräts die Ausrichtung von Partikeln vor dem Durchqueren eines Abfragebereichs für die Einzelpartikelanalyse ist, wurden auch Experimente zur Fokussierung von PS-Perlen durchgeführt. In einer idealen Anwendung sollte ein solches Element eine gute Vielseitigkeit aufweisen und in der Lage sein, Partikel unterschiedlicher Größe zu zentrieren, ohne dass die Strömung oder die Geometrie geändert werden müssen, anders als dies bei auf Trägheit basierenden Techniken der Fall ist18. Um diese Qualität zu überprüfen, haben wir unser Gerät mit einer wasserbasierten Partikelmischung mit Durchmessern von 15 µm und 6 µm getestet und die Fokussierungsdimension auf eine größere Partikelgröße eingestellt, um sie konstant zu halten. Abbildung 4 zeigt das erhaltene Ergebnis: Verschiedene Partikel werden entlang der Mittelachse des Auslasskanals korrekt fokussiert, sowohl in der xy-Ebene als auch in der zx-Ebene (Abb. 4, Einschub). Wie aus der Linienprofilanalyse hervorgeht, sind die im Probenkanal fließenden Partikel zufällig über den Abschnitt verteilt, nach Eintritt in den Fokussierungsbereich ist ihre Verteilung jedoch um die Auslassachse zentriert und zeigt genau in der Mitte einen größeren Peak Kanal. Die Abweichung von ± 5 μm von dieser fokussierten Position ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass der begrenzte Fluss eine Abmessung hat, die der von größeren Partikeln entspricht. Daher können kleinere Partikel immer noch andere Positionen als das exakte Zentrum einnehmen. Transitbereiche von wenigen Mikrometern sind jedoch immer noch mit den meisten Abfragemethoden kompatibel.

Proof of Concept des vorgestellten Geräts. Der mikrofluidische Test wurde durch Injektion einer wasserbasierten Mischung aus PS-Kügelchen unterschiedlicher Größe, dh 15 μm und 6 μm, durchgeführt. Das Bild ist eine Überlagerung mehrerer Bilder, die mit 10.000 Bildern pro Sekunde mit einer Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommen wurden, die an ein optisches Mikroskop (10-fache Vergrößerung) gekoppelt ist. Alle Partikel sind in 3D korrekt entlang der Auslassachse ausgerichtet (Einschub a). Die Perlen sind zufällig über den Querschnitt des Probenkanals verteilt (Einschub b), aber sobald sie den Fokusbereich durchqueren, verteilen sie sich in einem engeren Bereich (~ 10 μm) neu (Einschub c). Die Zähldiagramme werden durch die Verarbeitung eines gesamten Videos mit etwa 1754 Bildern erhalten.

Um die Möglichkeiten unseres Geräts nicht nur beim Ausrichten, sondern auch beim Trennen von Wolken eintreffender Partikel besser zu verstehen, haben wir die Partikelgrößen durch die Verarbeitung einer wasserbasierten Lösung von 1-μm-Kügelchen an ihre Grenzen gebracht (Abb. 5). Während der Versuchsphase haben wir ausgehend von den simulierten Einlassdruckbedingungen (Probe 90 mbar, Hülle 190 mbar) die Fokussierungsfähigkeit des Chips in Bezug auf die kleine Kügelchenprobe weiter verbessert, indem wir die Betriebsdrücke leicht erhöht haben (Probe 97 mbar, Hülle 194 mbar). Interessanterweise werden die Partikel wieder entlang der Auslassachse fokussiert, obwohl die fokussierte Strömungsdimension größer als 1 μm ist. Das völlig unorganisierte Ensemble aus 1 μm großen Kügelchen im Probenstrom wird nach der Fokussierungsregion sortiert, was zu einer sehr guten Spitzenverteilung im Auslasskanal führt (Abb. 5a). Bemerkenswert ist, dass die Partikel, unabhängig davon, wie aggregiert sie sind, beim Durchlaufen der Fokussierungsströmung einzeln in den Fluidkorridor gelangen (Abb. 5b). In diesem Fall unterscheiden sich die begrenzten Positionen nur um 3 μm, was eine nahezu perfekte Ausrichtung zeigt.

Mikrofluidisches Experiment mit demselben Gerät durch Injektion einer wasserbasierten Lösung von 1 μm großen PS-Perlen (Probeneinlassdruck 97 mbar und Hülleneinlassdruck 194 mbar). (a) Das Bild ist eine Überlappung mehrerer Bilder, die von einer Hochgeschwindigkeitskamera mit 50.000 Bildern pro Sekunde aufgenommen wurden, gekoppelt an ein optisches Mikroskop (20-fache Vergrößerung). Die einströmenden Partikel werden im Probenkanal zufällig verteilt und anschließend im Auslasskanal präzise ausgerichtet. Die Ausrichtungsgenauigkeit ist extrem hoch und zeigt eine mögliche Verschiebung von nur 3 μm. Die Diagramme zur Linienprofilzählung werden durch die Verarbeitung eines Videos mit etwa 2100 Bildern erhalten. (b) Einzelbild des erfassten Videos, das zeigt, dass die Partikel beim Durchlaufen des Fokussierungsbereichs gut aufgeteilt und einzeln in den Auslasskanal gesendet werden.

Darüber hinaus war es aus diesem Experiment möglich, die durch numerische Simulationen erhaltene Strömungsgeschwindigkeitskarte zu validieren (Abb. 2 a). Aufgrund der geringen Größe der Perlen kann man davon ausgehen, dass sie sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie die Strömung bewegen. In diesem Experiment wurden bei Probeneinlassdrücken von 97 mbar (simuliert 90 mbar) und 194 mbar für den Manteleinlass (simuliert 190 mbar) Partikel gemessen, die mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von etwa 0,4 m/s strömten, ähnlich der Strömung in der Simulation. Unter Berücksichtigung einer Querschnittsdurchgangsfläche von ~ 15 μm × 15 μm für den Probenfluss (aufgrund der Fokussierung) beträgt der tatsächliche Durchsatz – d. h. der volumetrische Verbrauch über die Zeit nur der zu verarbeitenden Probe – 0,35 ml/h. Dank der soliden mechanischen Eigenschaften des Gerätes lässt sich der Betriebsdruckbereich jedoch deutlich erweitern und erreicht Eingangswerte in der Größenordnung von mehreren Bar. In diesem Fall haben numerische Simulationen gezeigt, dass sich die fokussierte Strömungsgeschwindigkeit Werten in der Größenordnung von mehreren zehn m/s annähert, was zu Durchsätzen von mehreren zehn ml/h führt. Bei der Verwendung von Flüssigkeiten unterschiedlicher Viskosität ist Vorsicht geboten, da die Arbeitspunkte (Psample -Pbuffer) von den hier typischerweise gezeigten abweichen. Dennoch ist es möglich, Arbeitspunkte zu identifizieren, die die gleichen Fokussierungsergebnisse erzielen.

Schließlich wurde als Machbarkeitsnachweis der hydrodynamische Fokussierungsabschnitt zur Partikelerkennung in einen einfachen Photozytometer-Chip integriert. Abbildung 6a zeigt die Geräteskizze. Der Abfragebereich besteht aus zwei voreinander angeordneten optischen Fasern (Singlemode-Faser für den Anregungszweig und Multimode-Faser für den Sammelzweig). Dank dieser optischen Konfiguration ist der vom Laserstrahl eingenommene Kanalabschnitt (quer zur Strömung) auf eine schmale Linie von etwa 5 µm Durchmesser begrenzt, die gut in der Mitte des Hauptkanals liegt. Wenn das Partikel an den Fasern vorbeiläuft, verdeckt es den Sondenstrahl, was zu einer Verringerung des von der anderen Faser gesammelten Lichts führt. Die Leistung des Lab-on-a-Chip für eine solche automatische Zählung hängt eng mit der effektiven Trennfähigkeit und der genauen 3D-Positionskontrolle mikrometrischer Objekte innerhalb des Kanals zusammen. Verschiebungen von wenigen Mikrometern relativ zur optischen Detektionsachse können die Messung beeinträchtigen, was die Bedeutung des zuvor entwickelten Fokussierungskonzepts unterstreicht. Um die erreichbare Fokussierungsauflösung, einen Proof of Concept, zu testen, wurde die Validierung des Chips mit Escherichia coli-Bakterien in Wasserlösung durchgeführt. Wie in Abb. 6 b und c dargestellt, streuen die Bakterien, wenn sie sich im Erkennungsbereich befinden, ausreichend Licht, um identifiziert zu werden. Dieser Nachweis erfolgt markierungsfrei und ist daher nicht in der Lage, ein Bakterium von einem Partikel gleicher Größe zu unterscheiden. Dennoch ist es durch die Analyse der Peakbreite möglich, Partikel unterschiedlicher Größe zu erkennen.

(a) Skizze des optofluidischen Zytometers für die Einzelpartikelanalyse. Nach der hydrodynamischen Fokussierungszone passieren die ausgerichteten Partikel ein paar Fasern (Einschubzoom). Die Streuung des Sondenstrahls durch das Partikel ermöglicht dessen Detektion. (b) Einzelbild des erfassten Videos, das ein Bakterium zeigt, das Licht streut, das im Erkennungsbereich passiert (Pinlet-Probe = 97 mbar; Pinlet-Hülle = 194 mbar). (c) Typisches vom Fotodetektor erfasstes Signal.

Die Analyse von Mikropartikeln hat aufgrund der großen Bandbreite an Informationen, die extrahiert werden können, in jüngster Zeit die Aufmerksamkeit der Mikrofluidik-Forschung auf sich gezogen. In diesem Zusammenhang kommt der Partikelmanipulation innerhalb mikrofluidischer Netzwerke eine entscheidende Bedeutung zu. Wir haben erfolgreich ein einzigartiges 3D-Mikrofluidikgerät mit Flussfokussierung vorgeschlagen, hergestellt und charakterisiert, das in einem Quarzglassubstrat eingebettet ist und Vorteile wie Kompaktheit, hohe Integrierbarkeit, hohe Durchsätze und einfache Bedienung vereint. Durch die Konstruktion eines Probenkanals, der in einem größeren Pufferkanal aufgehängt ist, war es möglich, durch die Verwendung von nur zwei Einlässen eine symmetrische hydrodynamische 3D-Fokussierung mit einer Breite von weniger als 10 μm zu erreichen. Dies ermöglichte es, eine Mischung aus PS-Partikeln von 15 μm und 6 μm mit einer Genauigkeit von ± 5 μm und eine Lösung aus 1 μm großen PS-Kügelchen mit einem Fehler von nur 3 μm in einem zentralen Fluss (räumlich und zeitlich stabil) einzuschließen . Die FLICE-Herstellungstechnik ermöglichte es, die Geometrie aus einem einzigen Substrat aus Quarzglas zu schnitzen, was dem Gerät eine außergewöhnliche mechanische Robustheit verlieh und somit hohe Durchsätze ermöglichte. Zusätzlich zu den 3D-Fertigungsmöglichkeiten bietet diese Technik auch die Möglichkeit, selbstausrichtende photonische Elemente – wie optische Elemente, optische Fasern und Wellenleiter – einfach in das mikrofluidische Netzwerk zu integrieren und so die Herstellungsschritte erheblich zu vereinfachen.

All diese einzigartigen Vorteile, kombiniert mit seiner extremen Kompaktheit (Gesamtlänge ~ 2 mm) und seinem völlig verstopfungsfreien Verhalten, zeigen, dass das vorgeschlagene Gerät alle Merkmale aufweist, die die Implementierung einer vollständig mikrofluidischen Plattform für biologische und chemische Partikel vorantreiben könnten Wahrnehmung. Tatsächlich kann die vorgeschlagene Geometrie ein grundlegendes Werkzeug für fortgeschrittene Studien zur hochempfindlichen Erkennung von Schadstoffen in Flüssigkeiten (Bakterien, Mikroplastik, Schwermetalle), zur Analyse der Zellsteifigkeit und zur statistischen Untersuchung aller Partikel sein, die zur Emission gebracht werden können (Fluoreszenz) oder Streuung.

Numerische Simulationen wurden mit COMSOL Multiphysics 5.3a unter Verwendung der Basis- und Mikrofluidikmodule durchgeführt. Für alle Simulationen wurde eine Hybridnetzlösung verwendet: grobes Netz in den am wenigsten interessanten Bereichen (z. B. die Verbindungsrohre), feines Netz für den 200-µm-Kanal und superfeines Netz für die gesamte Kugel und den hydrodynamischen Fokusbereich. Die Randbedingungen wurden für die Wände des gesamten Chips auf rutschfeste Bedingungen eingestellt, während auf die Einlässe unterschiedliche Drücke ausgeübt wurden, um das Verhalten unter verschiedenen Umständen zu simulieren. Um den Querschnitt zweier identischer Flüssigkeiten (Puffer und Probe) unter Strömungsbedingungen korrekt darzustellen (Abb. 3c), wurde eine geeignete Simulationsstrategie verwendet: Die beiden Strömungen (Probe und Puffer) wurden als Satz kleiner Kugeln von 50 nm nachgeahmt (rot für Puffermoleküle – blau für Probenmoleküle), die von ihren jeweiligen Eingängen ausgehen und sich durch das Gerät ausbreiten. Für jeden Einlass wurden 10.000 Perlen freigesetzt, wodurch die in der Erfassung angegebenen Drücke ausgeübt wurden (Pinlet-Probe = 80 mbar; Pinlet-Hülle = 110 mbar). Die Partikel wurden so eingestellt, dass sie nicht miteinander interagieren (was zu einem Übermaß an nicht viskoser Flüssigkeit führt), während wir für die Wände rutschfeste Bedingungen festlegen. Sobald der Querschnitt stationär war, wurde er Hunderte Mikrometer von der Fokussierungszone entfernt beobachtet.

Die FLICE-Technik37,38,39,40,41 basiert auf zwei Hauptschritten: Femtosekunden-Laserbestrahlung und Nassätzen. Ersteres verleiht dieser Fertigungstechnik die außergewöhnliche Fähigkeit, Geometrien – auch komplexe – in 3D zu entwerfen. Das Verfahren nutzt die Multiphotonenabsorption, um das Material selektiv nur im Spotvolumen zu modifizieren und dabei räumliche Auflösungen von weniger als 1 bzw. 5 μm in Quer- und Längsrichtung zu erreichen. Sobald das Material dem Laserstrahl ausgesetzt wird, wird es dauerhaft verändert und je nach Lichtpolarisation werden Nanostrukturen – auch Nanogitter genannt – erzeugt und ausgerichtet41. Durch die Abstimmung ist es möglich, die Geschwindigkeit des zweiten Schritts, eines nasschemischen Ätzens, basierend auf einer wässrigen Flusssäurelösung (HF) mit einer HF-Konzentration von 20 %, zu modulieren. Die chemische Lösung reagiert schneller mit dem modifizierten Material und ermöglicht eine selektive Entfernung, die zur Bildung hohler Strukturen führt, ausgehend von einem einzelnen Quarzglassubstrat42,43,44,45. Unser Mikrobearbeitungsaufbau besteht aus einem verstärkten Yb:KGW-Femtosekundenlasersystem (Pharos, Lichtkonversion) mit einer Pulsdauer von 230 fs, einer Wellenlänge von 515 nm (Frequenz verdoppelt) und einer Wiederholungsrate von 500 kHz, fokussiert mit einem 50 × –0,42 NA-Mikroskopobjektiv (M Plan Apo SL50X Ultra-Long Working Distance Plan-Apochromat, Mitutoyo). Computergesteuerte 3-Achsen-Bewegungstische (ABL-1000, Aerotech), die über eine CAD-basierte Software (ScaBase, Altechna) mit einem integrierten akusto-optischen Modulator verbunden sind, werden verwendet, um die Probe relativ zum gewünschten Laserbestrahlungsfeld zu verschieben. Aufgrund der für die Herstellung des internen Kanals erforderlichen Genauigkeit wurden die Parameter so eingestellt, dass ein Ätzschritt mit hoher Geschwindigkeit gewährleistet wird, wobei der Effekt unterschiedlicher Laserpolarisationen und einer dichten Volumenfüllung (mit Abständen von 6 bis 6 μm) ausgenutzt wird. Die Laserbestrahlung wurde so eingestellt, dass sie eine durchschnittliche Leistung von 200 mW (400 nJ) auf die Probe abgibt und diese mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/s abtastet.

Die mikrofluidischen Experimente wurden in einem kontrollierten Injektionsdrucksystem von Elveflow (OB1MK3) durchgeführt, was eine hohe Auflösung und eine stabile Druckregulierung gewährleistet. Die Quarzglasgeometrie wurde über PEEK-Schläuche mit einem Innendurchmesser von 150 μm und einer Länge von 7 cm mit dem Injektionssystem verbunden. Um die Strömung von Flüssigkeiten und Partikeln im mikrofluidischen Gerät beobachten zu können, wurden die Tests unter einem optischen Mikroskop (BX53M, Olympus) durchgeführt, das an eine Hochgeschwindigkeitskamera (FASTCAM Mini UX100 Typ 800k-M-16G, Photron) gekoppelt war. Experimente erforderten die Aufnahme von Videos mit Bildraten zwischen 10.000 und 50.000 fps. Die Bilder wurden mit der Software Photron FASTCAM Viewer 4 (PVF4) oder ImageJ erfasst und verarbeitet. Um weitere Informationen zu extrahieren, wurde der spezielle Matlab-Algorithmus (MATLAB, Version R201b, Natick, Massachusetts: The MathWorks Inc.) implementiert und verwendet.

Das Gerät wurde entwickelt, um einen einströmenden Hauptstrom zu fokussieren und die darin transportierten Partikel entlang der Mittelachse des Auslasskanals auszurichten. Es wurden mehrere Charakterisierungsexperimente durchgeführt. Zunächst wurde die Strömungskonfiguration bewertet und mit den Ergebnissen numerischer Simulationen verglichen. Dazu wurde eine wasserbasierte blaue Farbstofflösung mit einem konstanten Druck von 80 mbar in den Probeneinlass injiziert, während eine entionisierte Wasserlösung in den Mantelkanal geleitet wurde, wobei der Druck zwischen 60 und 160 mbar variiert wurde. Anschließend wurde das Partikelfokussierungsverhalten untersucht, indem sowohl eine wasserbasierte Mischung aus 15 μm und 6 μm großen Polystyrolkügelchen (42716 und 42718 Polystyrol (PS)-Latex-Mikrokugeln, 2,5 Gew.-%ige Dispersion, Alfa Aesar) als auch eine Lösung von 1 μm verwendet wurden Partikel (Gew. 2,5 %, Sigma-Aldrich), in zwei verschiedenen Experimenten. Schließlich wurden dem hydrodynamischen Fokussierungselement ein paar optische Fasern (M42L01 und P1-460B-FC-1, Thorlabs) hinzugefügt, um den Durchgang von Partikeln vor ihnen zu erkennen. Als Proof of Concept der biologischen Anwendbarkeit wurde dieser Chip auf den Nachweis von Mikroorganismen getestet, insbesondere wurden Bakterien des Stammes 25922 von Escherichia coli verwendet. Luria-Bertani (LB)-Brühe und LB-Agar wurden jeweils für Flüssigkultur- und Plattenwachstumstests verwendet. Die flüssigen Bakterienkulturen wurden über Nacht in LB-Medium in einem Inkubator bei einer konstanten Temperatur von 37 °C und einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/min gezüchtet. Bevor sie auf LB-Agarplatten übertragen wurden, wurden sie auf OD600 0,5 verdünnt. Anschließend wurden sie für die In-Chip-Tests in Wasser mit zufälliger Konzentration suspendiert. Von der Größe her lassen sich die verwendeten Bakterien als Stäbchen dieser Nenngröße identifizieren: Durchmesser 200–300 nm und Länge 1–2 µm.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Zentrum für Nanowissenschaft und -technologie, Italienisches Technologieinstitut, Via Rubattino 81, 20134, Mailand, Italien

Filippo Storti, Silvio Bonfadini und Luigino Criante

Fakultät für Physik, Polytechnikum Mailand, Piazza Leonardo da Vinci, 32, 20133, Mailand, Italien

Filippo Storti

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Konzeptualisierung, FS; Methodik, LC; Software, FS.; Validierung, FS, SB; formale Analyse, FS, SB; Untersuchung, FS und SB; Ressourcen, LC; Datenkuration, FS, SB; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, FS; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, SB; Aufsicht, LC; Projektverwaltung, LC. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Luigino Criante.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Storti, F., Bonfadini, S. & Criante, L. Vereinfachte hydrodynamische 3D-Strömungsfokussierung für Lab-on-Chip-Einzelpartikeluntersuchungen. Sci Rep 13, 14671 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40430-z

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Eingegangen: 09. März 2023

Angenommen: 10. August 2023

Veröffentlicht: 06. September 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40430-z

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Vereinfachte hydrodynamische 3D-Strömungsfokussierung für das Labor