Aktivierung von Nano

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12748 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Während die Radioembolisierung mit Yttrium-90 (Y-90)-Mikrokügelchen eine vielversprechende Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC) ist, stellen geringere Reaktionen bei fortgeschrittenen und hochgradigen Tumoren einen dringenden Bedarf dar, ihre tumorizide Wirksamkeit zu erhöhen. Der Zweck dieser Studie bestand darin, festzustellen, ob klinisch verwendete Y-90-Mikrokügelchen lichtempfindliche Nano-Photosensibilisatoren aktivieren, um den oxidativen Stress und die Zytotoxizität von Hepatozellulären Karzinomzellen (HCC) gegenüber Y-90 allein in vitro zu verstärken. Die Produktion von Singulett-Sauerstoff und Hydroxylradikalen wurde gesteigert, wenn Y-90-Mikrokügelchen in Gegenwart mehrerer Nano-Photosensibilisatoren waren, im Vergleich zu beiden allein unter zellfreien Bedingungen. Sowohl die menschlichen SNU-387- als auch die HepG2-HCC-Zellen zeigten eine deutlich geringere Lebensfähigkeit, wenn sie mit Y-90-Mikrokügelchen mit geringer Aktivität (0,1–0,2 MBq/0,2 ml) und einem Nano-Photosensibilisator bestehend aus Titandioxid (TiO2) und Titanocen (TC) behandelt wurden. markiert mit Transferrin (TiO2-Tf-TC) im Vergleich zu Y-90-Mikrosphären allein oder unbehandelten Zellen. Zellulärer oxidativer Stress und Zelltod zeigten bei höheren Aktivitäten (bis zu 0,75 MBq/0,2 ml) eine lineare Abhängigkeit von Y-90, waren jedoch in Gegenwart steigender TiO2-Tf-TC-Konzentrationen im schlecht differenzierten SNU-387 deutlich stärker ausgeprägt HCC-Zelllinie (p < 0,0001 bzw. p = 0,0002), jedoch nicht die gut differenzierte HepG2-Zelllinie. Die Zugabe von TiO2-Tf-TC zu normalen menschlichen Hepatozyten-THLE-2-Zellen erhöhte den zellulären oxidativen Stress oder den Zelltod in Gegenwart von Y-90 nicht. Die verstärkte tumorizide Aktivität von Nano-Photosensibilisatoren mit Y-90-Mikrokügelchen ist eine potenziell vielversprechende Zusatzbehandlungsstrategie für bestimmte Patientengruppen. Anwendungen in klinisch relevanten In-vivo-HCC-Modellen sind im Gange.

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine primäre bösartige Lebererkrankung, die weltweit die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache darstellt. Es wird erwartet, dass sie in der westlichen Bevölkerung weiter zunehmen wird, da chronische Lebererkrankungen als Folge einer nichtalkoholischen Steatohepatitis erheblich zunehmen1,2,3. 4. Trotz der jüngsten Fortschritte bei systemischen Wirkstoffen wie der Immuntherapie gibt es nach wie vor eine beträchtliche Kohorte von Nicht- oder schwachen Respondern auf diese Wirkstoffe, sodass therapeutische Innovationen erforderlich sind5. Bei der Yttrium-90 (Y-90)-Radioembolisierung handelt es sich um die minimalinvasive, bildgesteuerte Abgabe von Mikrokügelchen, in die das hochenergetische, reine Beta-emittierende Radionuklid Y-90 eingebettet ist, an Lebertumoren auf präzise und selektive Weise direkt über deren arterielle Versorgung hochkonzentrierte interne Strahlentherapie6. Effektive und langanhaltende objektive Reaktionen werden erzielt, wenn Y-90-Mikrokügelchen mit hohen absorbierten Strahlungsdosen an HCC-Tumoren abgegeben werden7,8,9. Dennoch gibt es mehrere Einschränkungen bei der Y-90-Radioembolisierung, einschließlich geringerer Ansprechraten bei Patienten mit fortgeschrittenen HCC-Stadien, solchen mit schlecht differenzierten Tumoren und wenn aufgrund schlechter Gefäße keine ausreichende Y-90-Strahlungstumordosis erreicht werden kann Leitungen oder signifikante Dosisheterogenitäten auf Mikrodosimetrieebene10,11,12,13,14. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, dieses Behandlungsparadigma zu erneuern, um die zytotoxische Wirksamkeit von Y-90 bei niedrigeren Strahlendosen zu verbessern und die Behandlungsvorteile auf diese gefährdeteren und risikoreicheren Patienten auszudehnen.

Beta-emittierende Radionuklide emittieren nahe ultraviolettes bis blaues sichtbares Licht, bekannt als Tscherenkow-Strahlung (CR)15,16,17. Dieses Licht kann zusammen mit der direkten Energie des Betateilchens lichtempfindliche Arzneimittel, sogenannte Nano-Photosensibilisatoren, aktivieren, um durch einen photodynamischen Therapieprozess (PDT) tumorizide reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen (Abb. 1A)17,18. In vivo führt die PDT zum Tod des Tumors durch mehrdimensionale Prozesse, die direkte Zellschädigung, mikrovaskuläre Abschaltung und Aktivierung der Antitumor-Immunantwort durch immunogenen Zelltod umfassen19. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Positronenemitter wie F-18, Zr-89 und Ga-68 als wirksame Aktivierungsquellen für Nano-Photosensibilisatoren dienen können, um diese „tiefenunabhängige“ PDT zu erzeugen18,20,21,22,23. Y-90 hat sich als einer der hellsten und effizientesten CR-Strahler aller medizinisch genutzten Radionuklide erwiesen, was ihn zusammen mit seinem hochenergetischen Beta-Partikel in eine optimale Position versetzt, um Nano-Photosensibilisatoren zu aktivieren und so eine verbesserte tumorizide Wirksamkeit zu erreichen eine Kombination aus Strahlentherapie und PDT24,25,26,27,28.

Y-90 sendet ein optisches Signal aus, das um ein Vielfaches höher ist als andere Beta-emittierende Radionuklide. (A) β-emittierende Radionuklide wie Y-90 emittieren Cerenkov-Licht, das im UV-blauen Spektrum seinen Höhepunkt erreicht, wenn geladene Teilchen (dh β− oder β+) die Lichtgeschwindigkeit in einem bestimmten Medium überschreiten. Dieses Licht kann zusammen mit der Szintillation durch das geladene Teilchen selbst lichtaktivierbare Medikamente (Nano-Photosensibilisatoren) dazu anregen, aus H2O und O2 reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu produzieren, wodurch möglicherweise zusätzliche therapeutische Mediatoren für den Tod von Krebszellen eingeführt werden. (B) Breitspektrum-optische Ausgabe von Y-90 (in Y-90Cl3-Form) im Vergleich zu der von FDG und Zr-89 bei gleichen Aktivitäten (0,925 MBq), gemessen auf einem IVIS Illumina (4 Minuten Belichtung, 4 Binning, 10 cm Feld). Sichtweite, Blende 1, offener Filter, Anregung blockiert). (C) Y-90 zeigte Photonenflüsse, die mehr als fünfmal höher waren als die von Zr-89 und mehr als 16-mal höher als die von FDG. (D) Y-90 wies eine durchschnittliche Strahldichte auf, die mehr als sechsmal höher war als die von Zr-89 und mehr als 17-mal höher als die von FDG. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei Messungen dar.

In dieser Studie haben wir festgestellt, ob Y-90 in seiner klinisch verwendeten Mikrosphärenform auf UV-Strahlung reagierende Nano-Photosensibilisatoren aktivieren kann, um tumorizide ROS zu erzeugen und den HCC-Zelltod in vitro bei Aktivitäten zu induzieren, die annähernd absorbierten Strahlungsdosen entsprechen, die niedriger sind als typischerweise für die HCC-Tumorreaktion erforderlich die Klinik nach dem Medical Internal Radiation Dose (MIRD)-Modell (< 180 Gy). Unsere Ergebnisse zeigten, dass Y-90 eine um ein Vielfaches höhere Lumineszenzausbeute aufweist als andere klinisch eingesetzte Betastrahler. Die Behandlung verschiedener Nano-Photosensibilisatoren mit Y-90-Mikrokügelchen erzeugte tumorizide Singulett-Sauerstoff- und Hydroxylradikale in zellfreien Medien. Mit einem dualen Nano-Photosensibilisator bestehend aus Titandioxid (TiO2) und Titanocen (TC), markiert mit Transferrin (Tf) zur Erleichterung der Aufnahme in Tumorzellen (TiO2-Tf-TC), zeigen wir, dass die Behandlung mit Y-90-Mikrokügelchen zellulären und mitochondrialen oxidativen Stress aktiviert um den Zelltod in hochmalignen und schlecht differenzierten SNU-387-HCC-Zellen zu verstärken29. Interessanterweise zeigten gut differenzierte HepG2-HCC-Zellen mit Y-90-Mikrokügelchen allein einen größeren Zelltod im Vergleich zu SNU-387-Zellen, und dies wurde durch Nano-Photosensibilisatoren nicht verstärkt. Wichtig ist, dass die Zugabe von Nano-Photosensibilisatoren den oxidativen Stress oder den Zelltod durch Y-90 in normalen menschlichen Leberzellen nicht erhöhte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Y-90 in seiner klinisch verwendeten Mikrosphärenform Nano-Photosensibilisatoren aktivieren kann, was zu einem verstärkten HCC-Zelltod mit potenziell größeren Auswirkungen auf bestimmte histologische Subtypen führt. Diese Ergebnisse stützen weitere Untersuchungen zur Verwendung von Nano-Photosensibilisatoren als Zusatzbehandlung und zu den unterschiedlichen Reaktionen von Y-90 allein bei verschiedenen HCC-Subtypen.

Y-90Cl3 wurde von Eckert und Ziegler Radiopharma (Berlin, Deutschland) bezogen. Sowohl F-18-Fluordesoxyglucose (FDG) als auch Zr-89 wurden in Übereinstimmung mit guten Herstellungspraktiken (GMP) von einem biomedizinischen CS-15-Zyklotron an unserer örtlichen Einrichtung gewonnen und hergestellt. Phantome, die 0,925 MBq jedes Radionuklids in dreifacher Ausfertigung enthielten, wurden in 96-Well-Platten mit klarem Boden und schwarzen Wänden auf einem IVIS Illumina (PerkinElmer, Waltham, MA) mit offenem Filter, 4-minütiger Belichtung, 4 Binning und 10 cm Sichtfeld abgebildet -Ansicht, Blende 1, Anregungsblock. Die optische Ausgabe eines breiten Spektrums wurde mithilfe einer Region-of-Interest-Analyse unter Verwendung der Living Image Software Version 2.60.1 (PerkinElmer, Waltham, MA) gemessen, um Werte für den Photonenfluss (Photon/s) und die Strahlungsdichte (Photon/s/cm2/sr) zu erhalten.

Für zellfreie ROS-Assays wurden Hypericin (Millipore Sigma, Burlington, MA), TiO2-Anatas-25-nM-Nanopartikel (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) und Titanocen (TC), formuliert in menschliches Serumalbumin, als Nano-Photosensibilisatoren verwendet. TiO2-basierte Nano-Photosensibilisatoren wurden auf die zuvor beschriebene Weise synthetisiert18. Kurz gesagt, Anatas-TiO2-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 25 nm (Sigma Aldrich Co.) wurden in entionisiertem Wasser suspendiert, um eine 10 mg/ml-Stammlösung zu bilden, die dann kräftig mit menschlichem Apotransferrin (Tf, Athens Research and Technology, Athens, GA) gemischt wurde ), gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung eines TiO2-zu-Tf-Massenverhältnisses von 1:3 und dispergiert durch Ultraschallbehandlung bei 3 W für 60 s mit einem Cole Parmer Ultraschallprozessor GE 130 PB (Cole Parmer, Vernon Hills, IL). Die Mischung wurde sofort durch einen 0,22 µm Polyethersulfon (PES)-Spritzenfilter (VWR Scientific, Batavia, IL) filtriert und 2 Vol.-% einer 12 mM TC-Lösung (Alfa Aesar, Tewksbury, MA) in DMSO zugegeben, was TiO2 ergab -Tf-TC. Die Größe der Suspensionen wurde mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines Malvern Zetasizer Nano ZS-Systems charakterisiert (ergänzende Abbildung 1). Ein ähnliches Protokoll wurde mit einem 12 µM Alexa680-markierten Tf (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) unter Verwendung eines TiO2-zu-Tf-Massenverhältnisses von 1:3 verwendet, um TiO2-Alexa-Tf zu erhalten.

HSA-TC wurde auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben synthetisiert und charakterisiert20. Kurz gesagt wurden 80 mg TC in 16 ml einer 0,5 %igen wässrigen HSA-Lösung aufgenommen und die Mischung 6 Stunden lang mit 560 Schwingungen pro Minute in einem IKA KS 130 Basis-Plattenschüttler bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Mischung wurde dann sofort einer Gefriertrocknung im gekühlten Dampffallen-Lyophilisator Thermo Fischer SAVANT RVT5105 unterzogen, um die HSA-TC-Nanopartikel als orangerotes Trockenpulver zu erhalten. Die trockenen Pulver wurden unmittelbar vor der Verwendung in den zellfreien Tests oder in Zellstudien in DPBS rekonstituiert. Die Größenverteilungen und Konzentrationen wurden auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben bestätigt20.

Harz-Y-90-Mikrokügelchen (SirSpheres, Sirtex, Woburn, MA) wurden nach routinemäßiger klinischer Verwendung als unbenutzte übrig gebliebene Fläschchendosen erhalten und unter institutioneller und Strahlenschutzgenehmigung und -protokoll in unser Labor überführt. Y-90 SirSpheres war die einzige Form von Mikrosphären, die in dieser Studie verwendet wurde. Sowohl Singulett-Sauerstoff- als auch Hydroxylradikal-Zellfreiheitstests wurden in 96-Well-Platten mit klarem Boden und schwarzen Wänden (Corning, Corning NY) mit geeigneten Konzentrationen an Nano-Photosensibilisatoren und Aktivitäten von Y-90-Mikrokügelchen in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml durchgeführt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Life Technologies, Carlsbad, CA). Für die Messung von Singulett-Sauerstoffradikalen wurde Singulett-Sauerstoff-Sensor-Grün (SOSG)-Reagenz (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) in einer Endkonzentration von 5 μM in jede Vertiefung unter Versuchsbedingungen gegeben. Die Aktivierung des SOSG-Reagens durch Singulett-Sauerstoffradikale wurde durch Messung der 504-nm-Anregungs-/525-nm-Emissionsfluoreszenz gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines Synergy HT-Multimode-Plattenlesegeräts (BioTek Instruments Inc) unmittelbar vor und zu mehreren Zeitpunkten nach der Zugabe von Y-90-Mikrokügelchen bestimmt bis zu 48 Std. Zu den Versuchsbedingungen gehörten PBS allein, Nano-Photosensibilisator allein (Hypericin 500 nM, TC 1 μM oder TiO2 50 μg/ml) und Y-90-Mikrokügelchen allein (0,26 MBq/0,2 ml oder 0,52 MBq/0,2 ml) als Kontrollen und Nano -Photosensibilisator (Hypericin 200 nM oder 500 nM, TC 0,1 μM oder 1 μM oder TiO2 10 μg/ml oder 50 μg/ml) zu Y-90-Mikrokügelchen hinzugefügt. Die Aktivitäten von 0,26 MBq und 0,52 MBq wurden gewählt, da sie ungefähr 65 Gy bzw. 130 Gy entsprechen, unter Annahme der MIRD-Methode (Medical Internal Radiation Dose) in einem Raumvolumen von 0,2 ml. Das Abfangen von Singulett-Sauerstoffradikalen wurde durch Zugabe von Natriumazid (NaN3, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) in einer Endkonzentration von 5 μM zu Y-90-Mikrokügelchen plus Nano-Photosensibilisator-Bedingungen bewertet. Jede Versuchsbedingung wurde fünfmal wiederholt.

Zur Messung der Hydroxylradikale wurde Hydroxyphenylfluorescein (HPF)-Reagens (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) in einer Endkonzentration von 5 μM in jede Vertiefung unter Versuchsbedingungen gegeben. Die Aktivierung des HPF-Reagens durch Hydroxylradikale wurde durch Messung der 490-nm-Anregungs-/515-nm-Emissionsfluoreszenz gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des oben genannten Plattenlesegeräts (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT) unmittelbar vor und zu mehreren Zeitpunkten nach der Zugabe von Y-90 bestimmt Mikrosphären bis zu 72 h. Die Versuchsbedingungen waren identisch mit denen für Singulett-Sauerstoff, außer dass die Versuchsbedingungen für Natriumazid (NaN3) fehlten. Jede Versuchsbedingung wurde fünfmal wiederholt.

SNU-387-HCC-Zellen waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Terence Gade (Abteilung für Radiologie, University of Pennsylvania). HepG2-HCC-Zellen wurden von ATCC (Manassas, VA) erhalten. Die an unserer Einrichtung durchgeführte STR-Profilierung ergab, dass beide Zelllinien den Referenzstandards gemäß den ATCC-Richtlinien entsprachen. Der Differenzierungsstatus beider Zelllinien basierte auf transkriptomischen Klassifizierungen von Caruso et al., wobei HepG2-Zellen durch gut differenzierte, mit Hepatoblasten-ähnlichen Merkmalen gekennzeichnet waren und SNU-387 durch weniger differenzierte, invasive, mit mesenchymalen Merkmalen gekennzeichnet war29. SNU-387- und HepG2-Zellen wurden in Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) bzw. Eagle's Minimum Essential (EMEM) (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) gehalten, beide ergänzt mit 10 % Fötus Rinderserum (Gibco) und 0,5 % Penicillin/Streptomycin. Die normale menschliche Leberepithelzelllinie THLE-2 wurde von ATCC (Manassas, VA) erhalten und in Wachstumsmedien für Bronchialepithelzellen (Lonza, Basel, Schweiz), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Gibco) und 0,5 % Penicillin/Streptomycin, gehalten . Alle Zelllinien wurden in einem ummantelten, befeuchteten CO2-Inkubator (5 %) bei 37 °C gehalten und bei Konfluenz passagiert. Die Tests der Kernanlage unserer Einrichtung auf Kontaminanten wie Mykoplasmen waren negativ.

Nach dem Wachstum bis zur Konfluenz wurden SNU-387-Zellen mit einer Dichte von 8000 Zellen/Well auf schwarzwandigen 96-Well-Platten mit klarem Boden ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit TiO2-Alexa-Tf-Nano-Photosensibilisatoren behandelt. Sowohl die konfokale Hellfeld- als auch die Fluoreszenzmikroskopie wurden 4, 24 und 72 Stunden nach der Behandlung unter Verwendung eines konfokalen Olympus FV1000-Mikroskops unter Verwendung des AlexaFluor 633-Anregungs-/Emissionskanals durchgeführt. Die Überlagerung von Fluoreszenz- und Hellfeldbildern mit Falschfarben wurde mit der Software Fluoview FV10-ASW von Olympus durchgeführt.

Nach dem Wachstum bis zur Konfluenz wurden alle Zelllinien mit einer Dichte von 8000 Zellen/Well auf schwarzwandigen 96-Well-Platten mit klarem Boden (Corning, Corning NY) ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der duale Nano-Photosensibilisator TiO2-Tf-TC in einer Endkonzentration von entweder 0 μg/ml (Kontrolle), 10 μg/ml oder 50 μg/ml zugegeben und dann 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden Y-90-Mikrokügelchen bei niedrigen oder hohen erwarteten Aktivitäten hinzugefügt. Angesichts der ausgeprägten Heterogenität und Absetzung der Y-90-Mikrokügelchen wurde die genaue Aktivität für jede Versuchsvertiefung durch Messung der offenen Filterlumineszenz auf einem Synergy HT-Multimode-Plattenlesegerät (BioTek Instruments Inc, Winooski, VT) unmittelbar nach der Zugabe der Y-90-Mikrokügelchen ermittelt und Normalisieren auf das, was aus Standardkurven erhalten wurde, die mit Y-90Cl3 bei identischen Plattenlesegewinnen erstellt wurden (ergänzende Abbildung 2). Nach 72-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde jeder Vertiefung HPF (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) mit einer Endkonzentration von 5 μM zugesetzt, um das Vorhandensein von Hydroxylradikalen zu bestimmen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Fluoreszenz unter Verwendung einer 490-nm-Anregung/515-nm-Emission mit dem oben genannten Plattenlesegerät gemessen. Dieselben experimentellen Schritte und Bedingungen wurden durchgeführt, um die mitochondriale Superoxidproduktion zu beurteilen, mit der Ausnahme, dass nach der 72-stündigen Inkubation das Medium abgesaugt wurde und MitoSOX Red-Reagenz (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) in einer Endkonzentration von 5 μM gemäß Herstellerangabe zugegeben wurde Anweisungen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Fluoreszenz unter Verwendung einer Anregung bei 510 nm/Emission bei 580 nm gemessen. Der Zelltod wurde mittels Propidiumiodid (PI)-Färbung (Millipore Sigma, Burlington, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter denselben experimentellen Bedingungen beurteilt. Für jede Nano-Photosensibilisator-Konzentration gab es mindestens 5 Experimente ohne Y-90 und 10 Experimente mit verschiedenen Y-90-Mikrosphärenaktivitäten.

Nach dem Wachstum bis zur Konfluenz wurden die beiden HCC-Zelllinien (SNU-387 und HepG2) mit einer Dichte von 8000 Zellen/Well auf schwarzwandigen 96-Well-Platten mit klarem Boden (Corning, Corning NY) ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert H. Anschließend wurde der duale Nano-Photosensibilisator TiO2-Tf-TC entweder in einer Endkonzentration von 0 μg/ml (Kontrolle) oder 50 μg/ml zugegeben und dann 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden Y-90-Mikrokügelchen bei geringer Aktivität (weniger als 0,2 MBq/0,2 ml) zugegeben und 72 Stunden lang inkubiert. Die genaue Y-90-Aktivität wurde durch Lumineszenzmessungen in jeder Bedingung unter Bezugnahme auf die oben beschriebenen Y90-Cl3-Standards ermittelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des Zelltiter-Glo-Lumineszenz-Assays (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Die Lumineszenz von Y-90 allein wurde durch Subtraktion der Hintergrundlumineszenz berücksichtigt, die unmittelbar vor der Zugabe des Cell-Titre-Glo-Reagenzes erhalten wurde. Jede Versuchsbedingung wurde mindestens dreifach durchgeführt.

Nach dem Wachstum bis zur Konfluenz wurden SNU-387-Zellen mit einer Dichte von 10.000 Zellen/Vertiefung auf einem Objektträger mit 8 Vertiefungen (Corning, Corning NY) ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen entweder mit Y-90-Mikrokügelchen (0,52 MBq/0,2 ml) allein, mit TiO2-Tf-TC (50 μg/ml) allein oder mit Y-90-Mikrokügelchen in Kombination mit TiO2-Tf-TC behandelt oder 72 Stunden lang unbehandelt. Anschließend wurde jeder Bedingung eine lebende/tote Zellfärbung bestehend aus Cyto-Farbstoff zur Färbung lebender Zellen und Propidiumiodid (PI) zur Färbung toter Zellen (Millipore Sigma, Burlington, MA) zugesetzt und 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert nach Herstellerangaben. Das Medium wurde abgesaugt, mit PBS gewaschen und die Zellen wurden mit Paraformaldehyd (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) fixiert. Die Zellen wurden dann bei 4 °C gelagert, bis das Y-90 vollständig zerfallen war (mehr als 10 Halbwertszeiten, etwa 30 Tage). Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie lebender und toter Zellen wurde unter Verwendung einer 488-nm-Anregung/518-nm-Emission bzw. 488-nm-Anregung/632-nm-Emission gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines konfokalen Olympus FV1000-Mikroskops durchgeführt. Die Überlagerung von Fluoreszenz- und Hellfeldbildern mit Falschfarben wurde mit der Software Fluoview FV10-ASW von Olympus durchgeführt.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.2 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) durchgeführt. Alle Daten zur optischen Ausgabe von Radionukliden, zur zellfreien ROS-Produktion und zur Lebensfähigkeit der Zellen werden als Testsignal im Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Signifikanz zwischen Versuchsgruppen wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA und anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstests bewertet. Für jede Nano-Photosensibilisator-Konzentration wurden zellbasierte HPF-, MitoSox- und PI-Werte gegen die Y-90-Mikrosphärenaktivität aufgetragen. Für jede Nano-Photosensibilisator-Konzentration wurde eine einfache lineare Regression durchgeführt und die Steigungsunterschiede mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA bestimmt. Als statistische Signifikanz wurde ein Alpha von weniger als 0,05 festgelegt.

Die Breitspektrum-Lumineszenz zeigte, dass Y-90 eine um ein Vielfaches höhere helle optische Leistung als F-18 oder Zr-89 hatte. Phantome mit gleichen Aktivitäten (0,925 MBq) von F-18-Fluordesoxyglucose (FDG), Zr-89 und Y-90 (in Y-90Cl3-Form) wurden auf einem IVIS Illumina (4 Minuten Belichtung, 4 Binning, 10 cm Feldabstand) abgebildet. Sichtfeld, Blende 1, offener Filter, Anregung gesperrt). Wie in Abb. 1 gezeigt, war die optische Lumineszenz von Y-90 im Vergleich zu Zr-89 mehr als fünfmal höher und im Vergleich zu F-18 mehr als 16-mal höher (Abb. 1B), gemessen durch beide Photonenflüsse (Photonen/s) ( Abb. 1C) und Strahlungsdichte (Photon/s/cm2/sr) (Abb. 1D), in Übereinstimmung mit früheren Berechnungen und Messungen30.

Die Erzeugung von Singulett-Sauerstoffradikalen, dem primären tumoriziden Mediator der photodynamischen Therapie (PDT), wurde mithilfe des Singulett-Sauerstoff-Sensor-Grün-Assays (SOSG) mit und ohne unterschiedliche Y-90-Mikrosphärenaktivitäten (0,26–0,52 MBq/0,2 ml, ungefähr 65–0,52 MBq/0,2 ml) bewertet. 130 Gy unter der Annahme von MIRD) und Nano-Photosensibilisator-Konzentrationen (Abb. 2). Bei höheren Nano-Photosensibilisator-Konzentrationen wurde ein deutlicher Anstieg der Produktion von Singulett-Sauerstoffradikalen beobachtet (mehr als das Dreifache mit Hypericin 500 nM, Abb. 2A, mehr als das Zweifache mit TC 1 μM, Abb. 2B; und bis zu das Zweifache mit TiO2 50 μg/ml, Abb. 2C) in Kombination mit sowohl niedrigen (0,26 MBq/0,2 ml) als auch höheren (0,52 MBq/0,2 ml) Aktivitäten von Y-90-Mikrokügelchen nach 48-stündiger Behandlung (alle p < 0,0001). Dieser Effekt wurde in Gegenwart des Singulett-Sauerstoffradikalfängers Natriumazid (NaN3) aufgehoben, was darauf hindeutet, dass dieses Signal tatsächlich auf die ROS-Produktion zurückzuführen ist31. Die Bildung von Hydroxylradikalen im Laufe der Zeit wurde mithilfe des Hydroxyphenylfluorescein (HPF)-Assays mit und ohne verschiedene Aktivitäten von Y-90-Mikrokügelchen und Konzentrationen von Nano-Photosensibilisatoren bewertet. Wie in Abb. 3 dargestellt, wurde bei höheren Konzentrationen der einzelnen Nano-Photosensibilisatoren und Y-90-Mikrokügelchenaktivitäten ein Anstieg der Hydroxylradikale beobachtet, der im Laufe der Zeit bis zu 72 Stunden anstieg (etwas mehr als eine Y-90-Halbwertszeit). Ähnlich wie die Produktion von Singulett-Sauerstoff schien die Produktion von Hydroxylradikalen aus Hypericin oder TC nicht durch höhere Y-90-Mikrosphärenaktivitäten beeinflusst zu werden (Abb. 3A, B). Allerdings war die TiO2-Erzeugung von Hydroxylradikalen bei höheren Y-90-Mikrosphärenaktivitäten erhöht (Abb. 3C). Weder Singulett-Sauerstoff noch Hydroxylradikale wurden durch Y-90-Mikrokügelchen oder Nano-Photosensibilisator allein in zellfreien Medien signifikant erzeugt (Abb. 2 und 3), ähnlich wie bei anderen Ergebnissen, bei denen therapeutische Beta-emittierende Radionuklide wie I-131 als Plattform verwendet wurden für PDT32. Insgesamt zeigten diese Daten, dass Y-90 eine hohe Lumineszenzausbeute aufwies und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Nano-Photosensibilisatoren und Y-90-Mikrokügelchen unter zellfreien Bedingungen deutlich gesteigert wurde.

Die Kombination von Y-90-Mikrokügelchen mit Nano-Photosensibilisatoren führt zu einer verstärkten Produktion von Singulett-Sauerstoffradikalen in zellfreien Medien. Ein deutlicher Anstieg der Singulett-Sauerstoffradialproduktion wurde in Gegenwart von Nano-Photosensibilisatoren (A) Hypericin 500 nM, (B) Titanocen gebunden an menschliches Serumalbumin (TC) 1 μM und (C) TiO2 50 μg/ml beobachtet, wobei beide niedrig waren und hohe Y-90-Mikrosphärenaktivitäten im Vergleich zu beiden allein. Dieser Effekt wurde in Gegenwart des Singulett-Sauerstoffradikalfängers Natriumazid (NaN3) verringert. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf Messungen dar. ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Die Kombination von Y-90-Mikrokügelchen mit Nano-Photosensibilisatoren führt im Laufe der Zeit zu einer verstärkten Produktion von Hydroxylradikalen in zellfreien Medien. Ein deutlicher Anstieg der Produktion von Hydroxylradikalen wurde in Gegenwart von Nano-Photosensibilisatoren (A) Hypericin 500 nM, (B) Titanocen gebunden an menschliches Serumalbumin (TC) 1 μM und (C) TiO2 50 μg/ml mit sowohl niedrigen als auch niedrigeren Konzentrationen beobachtet hohe Y-90-Mikrosphärenaktivitäten im Vergleich zu beiden allein. Dieser Effekt verstärkte sich mit der Zeit. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von fünf Messungen dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Für Experimente mit HCC-Zellen in vitro verwendeten wir einen mit Transferrin (Tf) markierten dualen Nano-Photosensibilisator, der sowohl aus TiO2 als auch TC (TiO2-Tf-TC) besteht, da frühere Arbeiten eine höhere tumorizide Wirksamkeit im Vergleich zu einzelnen Nano-Photosensibilisatoren mit geringerer Strahlungsdichte gezeigt haben Radionuklide18. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Transferrezeptor (TfR) in HCC überexprimiert wird und frühere Arbeiten mit Tf-markierten Nanopartikeln eine hohe Akkumulation in HCC-Tumoren im Vergleich zu nicht zielgerichteten Formulierungen in vivo zeigten33,34. Wir haben gezeigt, dass dieses mit AlexaFluor-680 markierte Nano-Photosensibilisator-Konstrukt in SNU-387-HCC-Zellen internalisiert wird (ergänzende Abbildung 3). Zellulärer oxidativer Stress, bewertet durch Hydroxylradikal- und mitochondriale Superoxidproduktion sowohl in schlecht differenzierten SNU-387- als auch in gut differenzierten HepG2-HCC-Zellen nach 72 Stunden, wurde unter Verwendung der HPF- bzw. Mitosox-Assays mit verschiedenen Y-90-Mikrosphärenaktivitäten und steigenden Konzentrationen getestet TiO2-Tf-TC. Die Analyse nach 72 Stunden wurde aufgrund des signifikanten Anstiegs der Hydroxylradikalbildung in zellfreien Medien (Abb. 3) zu diesem Zeitpunkt gewählt und betrug etwas mehr als eine Halbwertszeit von Y-90. Wie in Abb. 4A, B gezeigt, war die Erzeugung von Hydroxylradikalen in Gegenwart von Y-90-Mikrokügelchen allein ohne TiO2-Tf-TC erhöht und zeigte eine lineare Abhängigkeit von der Y-90-Aktivität (Abb. 4A, Anstieg von 69.337 HPF au pro). Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 65.145–73.529, r2 = 0,99 für SNU-387-Zellen und Abb. 4B, Anstieg von 4094 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 2932–5255, r2 = 0,92 für HepG2-Zellen). In schlecht differenzierten SNU-387-Zellen zeigten Bedingungen mit steigenden Konzentrationen von TiO2-Tf-TC in Gegenwart von Y-90-Mikrokügelchen eine deutlich stärkere Bildung von Hydroxylradikalen als ohne TiO2-Tf-TC und standen in linearem Zusammenhang mit Y-90 Aktivität (Abb. 4A, Anstieg von 88.426 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 83.815–93.037 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 111.557 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 105.464–117.650 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ml, beide r2 = 0,99, p < 0,0001), was darauf hindeutet, dass TiO2-Tf-TC den oxidativen Stress in HCC-Zellen in vitro verstärkte. Interessanterweise führte die Zugabe von TiO2-Tf-TC zu den gut differenzierten HepG2-Zellen nicht zu einem signifikanten Anstieg der Hydroxylradikalerzeugung (Abb. 4B, Anstieg von 5209 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 83.815). –93.037, r2 = 0,92 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 5.327 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 105.464–117.650, r2 = 0,91 für TiO2-Tf-TC 50 μg /ml, p = 0,1744).

Der zelluläre oxidative Stress von HCC durch Y-90-Mikrokügelchen wird in Kombination mit Nano-Photosensibilisatoren nach 72 Stunden in SNU-387-Zellen erhöht, nicht jedoch in HepG2-Zellen. (A) Die Produktion von Hydroxylradikalen in der SNU-387-HCC-Zelllinie hängt linear von der Aktivität der Y-90-Mikrokügelchen ab, ist jedoch in Gegenwart steigender Konzentrationen des dual gezielten Nano-Photosensibilisators TiO2-Tf-TC ausgeprägter (p < 0,0001). (B) Allerdings wurde in gut differenzierten HepG2-Zellen mit der Zugabe von TiO2-Tf-TC kein Unterschied in der Produktion von Hydroxylradikalen beobachtet (p = 0,1744). (C) In ähnlicher Weise hängt die Produktion von mitochondrialem Superoxid in SNU-387-Zellen ebenfalls linear von der Y-90-Mikrosphärenaktivität ab und ist in Gegenwart steigender Konzentrationen von TiO2-Tf-TC stärker ausgeprägt (p = 0,0002). (D) Allerdings wurde in HepG2-Zellen mit der Zugabe von TiO2-Tf-TC kein Unterschied in der mitochondrialen Superoxidproduktion beobachtet (p = 0,1087).

Die Produktion von mitochondrialem Superoxid in SNU-387-Zellen wurde auch in Gegenwart von Y-90-Mikrokügelchen allein ohne TiO2-Tf-TC in einem linearen Zusammenhang mit der Y-90-Aktivität erhöht (Abb. 4C, Anstieg um 44.941 MitoSox au pro Y-90). MBq/0,2 ml, 95 %-KI 37.002–52.880, r2 = 0,92). Ähnlich wie bei der Beobachtung bei der Erzeugung von Hydroxylradikalen wurde die Erzeugung von mitochondrialem Superoxid in SNU-387-Zellen mit steigenden Konzentrationen von TiO2-Tf-TC deutlich gesteigert (Abb. 4C, Anstieg von 55.698 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %). KI 48.665–62.732, r2 = 0,96 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 68.740 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 60.940–76.540 r2 = 0,97 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ml, p = 0,0002), was möglicherweise auf mitochondrialen oxidativen Stress hinweist, ein therapeutisches Nebenprodukt von Y-90 allein, das in Kombination mit Nano-Photosensibilisatoren in dieser Zelllinie noch verstärkt wird35. Während die mitochondriale Superoxidproduktion auch linear mit der Y-90-Aktivität in HepG2-Zellen zusammenhängt, wurde sie bei Zugabe von Nano-Photosensibilisator nicht signifikant gesteigert (Abb. 4D, Anstieg von 10.690 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 8459). –12.922, r2 = 0,9288 für Y-90 ohne TiO2-Tf-TC, Anstieg von 10.910 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 8319–13.501, r2 = 0,8752 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ ml und Anstieg von 14.452 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 10.895–18.009, r2 = 0,8913 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ml, p = 0,1087). Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass der zelluläre oxidative Stress durch Y-90-Mikrokügelchen in Gegenwart von Nano-Photosensibilisatoren in SNU-387-Zellen, nicht jedoch in HepG2-HCC-Zellen, verstärkt wurde, was auf unterschiedliche Effekte basierend auf histologischen Subtypen hindeutet.

Wir wollten herausfinden, ob TiO2-Tf-TC in Kombination mit ansonsten ungiftigen Y-90-Mikrosphärenaktivitäten den HCC-Zelltod auslösen würde. Um dies zu testen, haben wir die Zelllebensfähigkeit von SNU-387- und HepG2-Zellen durch ATP-Quantifizierung bestimmt, die mit TiO2-Tf-TC mit und ohne geringe Aktivitäten von Y-90-Mikrokügelchen (0,1–0,2 MBq/0,2 ml) behandelt wurden. Beide Zelllinien zeigten im Vergleich zu unbehandelten Zellen nach 72-stündiger Behandlung eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit mit der Kombination von Y-90-Mikrokügelchen und TiO2-Tf-TC, jedoch nicht mit einer davon allein (Abb. 5A, p = 0,0002 für SNU-387). Zellen, Abb. 5C, p = 0,0035 für HepG2-Zellen). Bei höheren Y-90-Aktivitäten (bis zu 0,75 MBq/0,2 ml) haben wir den Zelltod mithilfe der Propidiumiodid (PI)-Färbung bestimmt, da die Cerenkov-Emission von Y-90 die lumineszenzbasierten Zelllebensfähigkeitstests stärker stört. Wie in Abb. 5B gezeigt, war der Zelltod von SNU-387 linear von der Y-90-Aktivität abhängig (Anstieg von 60.793 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 44.126–77.459, r2 = 0,84), ähnlich wie bei zellbasierte Hydroxylradikale und mitochondriale Superoxidbefunde. Bedingungen mit steigenden Konzentrationen von TiO2-Tf-TC zeigten jedoch einen signifikant größeren SNU-387-Zelltod in Gegenwart von Y-90-Mikrokügelchen im Vergleich zu Bedingungen ohne TiO2-Tf-TC und standen auch in linearem Zusammenhang mit der Y-90-Aktivität (Abb . 5B, Anstieg von 81.450 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 71.662–91.238, r2 = 0,96 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 99.371 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 88.702–110.039, r2 = 0,97 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ml, p = 0,0002). Die konfokale Mikroskopie lebender/toter Zellfärbung von unbehandelten SNU-387-Zellen oder solchen, die nur mit TiO2-Tf-TC (50 μg/ml) behandelt wurden, zeigte überwiegend lebende Zellen (grüne Zytofarbstofffärbung, ergänzende Abbildung 4). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die nur mit Y-90-Mikrokügelchen behandelt wurden, nur minimale verbleibende lebende Zellen, während diejenigen, die mit kombinierten Y-90-Mikrokügelchen und TiO2-Tf-TC behandelt wurden, eine vollständige Abwesenheit lebender Zellen und das Vorhandensein nekrotischer Zellen (rote PI-Färbung) zeigten eine Fülle von Zelltrümmern (ergänzende Abbildung 4). HepG2-Zellen zeigten eine lineare und erhöhte Zelltodrate mit Y-90-Aktivität allein im Vergleich zu SNU-387-Zellen (Abb. 5D, Anstieg von 120.334 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 106.360–134.309, r2). = 0,9234 für HepG2 vs. Anstieg von 60.793 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 44.126–77.459, r2 = 0,8404 für SNU-387-Zellen, p < 0,0001). Ähnlich wie bei der Produktion von Hydroxylradikalen und mitochondrialem Superoxid wurde der Zelltod durch die Zugabe von Nano-Photosensibilisatoren in HepG2-Zellen nicht verstärkt (Abb. 5D, Anstieg um 118.912 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 102.727). –135.097, r2 = 0,89 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 141.732 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 123.651–159.814, r2 = 0,9009 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ ml, p = 0,0886). Insgesamt haben wir gezeigt, dass Nano-Photosensibilisatoren die durch Y-90-Mikrokügelchen vermittelte HCC-Zytotoxizität signifikant steigern.

Die HCC-Zytotoxizität von Y-90-Mikrokügelchen ist bei Kombination mit Nano-Photosensibilisatoren nach 72 Stunden erhöht. (A) Die durch ATP-Quantifizierung gemessene Lebensfähigkeit der SNU-387-Zellen wird durch die Kombination von TiO2-Tf-TC und Y-90-Mikrokügelchen bei einer Aktivität verringert, die mit Y-90 allein keine Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen verursacht (0,1–0,2). MBq/0,2 ml) (p = 0,0002). (B) Der Zelltod von SNU-387, gemessen durch Propidiumiodidaufnahme, hängt linear von der Aktivität der Y-90-Mikrokügelchen ab, ist jedoch in Gegenwart steigender Konzentrationen von TiO2-Tf-TC ausgeprägter (p = 0,0002). (C) HepG2-Zellen zeigten auch eine verminderte Lebensfähigkeit mit der Kombination von TiO2-Tf-TC und Y-90-Mikrokügelchen bei niedrigen Aktivitäten (p = 0,0035). (D) TiO2-Tf-TC führte jedoch nicht zu einem verstärkten Zelltod in HepG2-Zellen bei höheren Y-90-Aktivitäten, wie anhand der Propidiumiodidaufnahme festgestellt wurde (p = 0,0886). Bemerkenswert ist, dass der Grad des Zelltods pro Y-90-Aktivität allein bei HepG2-Zellen signifikanter war als bei den schlechter differenzierten SNU-387-Zellen (p < 0,0001). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für ANOVA-Mehrfachvergleiche in (A) und (C).

Wir wollten herausfinden, ob TiO2-Tf-TC den oxidativen Stress und den Zelltod in normalen menschlichen Leberzellen erhöht, was Auswirkungen auf zusätzliche unerwünschte Toxizitäten dieser kombinierten Behandlung hätte. Wie in Abb. 6A gezeigt, bestand ein linearer Zusammenhang mit der Y-90-Aktivität und der Erzeugung von Hydroxylradikalen in THLE-2-Zellen, dieser wurde jedoch bei gleichzeitiger Behandlung mit erhöhten Konzentrationen von TiO2-Tf-TC nicht erhöht (Anstieg um 24.593 HPF). au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 17.438–31.748, r2 = 0,81 für Y-90 ohne TiO2-Tf-TC, Anstieg von 26.016 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 20.808– 31.224, r2 = 0,90 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 24.593 HPF au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 17.438–31.748, r2 = 0,81 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ml ml, p = 0,387). Während in THLE-2-Zellen bei Zugabe von TiO2-Tf-TC ein Trend zu einer erhöhten mitochondrialen Superoxidproduktion zu verzeichnen war, war dies statisch nicht signifikant (Abb. 6B, Anstieg von 7590 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %). CI 5640–9540, r2 = 0,84 für Y-90 ohne TiO2-Tf-TC, Anstieg von 8935 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % CI 6240–11.630, r2 = 0,80 für TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 10.175 MitoSox au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 8606–11.743, r2 = 0,94 für TiO2-Tf-TC 50 μg/ml, p = 0,1923). Während es auch einen erwarteten linearen Zusammenhang mit dem Zelltod von THLE-2 und der Y-90-Aktivität gab, wurde dieser bei Zugabe von TiO2-Tf-TC nicht erhöht (Abb. 6C, Anstieg um 250.102 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml). 95 %-KI 233.598–266.606, r2 = 0,99 für Y-90 ohne TiO2-Tf-TC, Anstieg von 239.867 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 %-KI 227.952–251.782, r2 = 0,99 für Y-90 mit TiO2-Tf-TC 10 μg/ml und Anstieg von 201.086 PI au pro Y-90 MBq/0,2 ml, 95 % KI 180.258–221.914, r2 = 0,97 für Y-90 mit TiO2-Tf-TC 50 μg/ml) . Wie erwartet erhöhten Nano-Photosensibilisatoren weder den oxidativen Stress noch den Zelltod in normalen Leberepithelzellen.

Nano-Photosensibilisatoren erhöhen weder den oxidativen Stress noch den Zelltod in normalen menschlichen Hepatozyten. Die Produktion von (A) Hydroxylradikal, (B) mitochondrialem Superoxid und (C) Zelltod in THLE-2-Zellen war linear von der Y-90-Aktivität abhängig, wurde jedoch in Gegenwart von TiO2-Tf-TC nicht erhöht.

Angesichts der Tatsache, dass Y-90 einer der hellsten und effizientesten Cerenkov-Emitter klinisch verwendeter Beta-emittierender Radionuklide ist, stellten wir die Hypothese auf, dass es auch ein brauchbarer Aktivator von Nano-Photosensibilisatoren zur Steigerung der tumoriziden Aktivität von HCC24 wäre. Hier zeigen wir, dass Y-90, insbesondere in seiner klinisch verwendeten Mikrosphärenform (SirSpheres), lichtempfindliche Nano-Photosensibilisatoren aktiviert, um neben anderen ROS in zellfreien Medien tumorizide Singulett-Sauerstoffradikale zu erzeugen, die ein wichtiger Mediator der PDT sind. Darüber hinaus führte dies zu unterschiedlichen Wirkungen in HCC-Zelllinien in vitro, mit erhöhter zellulärer Hydroxyl- und mitochondrialer Superoxidproduktion zusammen mit erhöhter Zytotoxizität in der schlecht differenzierten SNU-387-HCC-Zelllinie, nicht jedoch in der gut differenzierten HepG2-HCC-Zelllinie. Dies bestätigt frühere Arbeiten, die zeigen, dass Betastrahler mit geringer Strahlungsdichte wie F-18, Zr-89 und Cu-64 Nano-Photosensibilisatoren aktivieren können, um eine tiefenunabhängige PDT zur Behandlung verschiedener bösartiger Erkrankungen zu ermöglichen18,20,21. Darüber hinaus weisen einige Beta-Strahler wie Ga-68 zwar eine mit Y-90 vergleichbare Cerenkov-Strahlung auf, letzteres hat jedoch den therapeutischen Vorteil einer längeren Halbwertszeit (68 Minuten gegenüber 64,1 Stunden) und einer gleichzeitigen hochenergetischen Beta-Minus-Emission Strahlentherapie22.

Die Zugabe verschiedener Nano-Photosensibilisatoren zu Y-90-Mikrokügelchen führte zu einer erheblichen Bildung des äußerst tumoriziden Singulett-Sauerstoffradikals, was darauf hindeutet, dass dieses Radionuklid eine potenzielle Quelle für PDT mit einer Vielzahl lichtaktivierbarer Verbindungen in der Natur sein kann. Dies steht im Einklang mit Modellen und Simulationen anderer, die vorhersagen, dass Y-90 eine ideale Cerenkov-Lichtquelle für PDT sein könnte36,37. Es ergänzt und erweitert auch die Erkenntnisse von Hartl et al. die eine erhöhte Zytotoxizität zeigten, wenn Gliom- und Brustkrebszellen mit dem Photosensibilisator TPPS2a und Y-90 in seiner Salzform (Y-90Cl3) behandelt wurden38. Der zeitabhängige Anstieg der Erzeugung von Hydroxylradikalen bei der Kombination von Nano-Photosensibilisatoren mit Y-90-Mikrokügelchen um bis zu 72 Stunden steht im Einklang mit der relativ langen Halbwertszeit von 64,1 Stunden, und es ist denkbar, dass die tumoriziden ROS noch stärker und wirksamer wären Dies wurde im klinischen Szenario der Radioembolisierung von Lebertumoren realisiert, bei dem die effektive Halbwertszeit von Y-90 weitaus größer ist als seine physische Halbwertszeit.

Im Gegensatz zu Beobachtungen in zellfreien Medien führte die Anwesenheit von Y-90 allein ohne Nano-Photosensibilisator in vitro zur Bildung von Hydroxyl- und mitochondrialen Superoxidradikalen und zum Tod von HCC-Zellen und hing linear von der Y-90-Aktivität ab. Dies ist nicht unerwartet, da die hochenergetische Beta-Partikel-Wechselwirkung in einer zellulären Umgebung wahrscheinlich zu anhaltenden und erhöhten nachgeschalteten oxidativen Nebenprodukten führt, was die tumorizide Aktivität widerspiegelt, die in der Klinik mit Y-90 allein beobachtet wurde39. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse einen erhöhten oxidativen Stress mit steigenden Konzentrationen von TiO2-Tf-TC, sowohl auf breiter Ebene mit erhöhter zellulärer Hydroxylradikalproduktion als auch speziell auf mitochondrialer Ebene mit erhöhter mitochondrialer Superoxidproduktion in den schlecht differenzierten SNU-387-Zellen. Obwohl diese beiden Oxidationsprodukte aufgrund der komplexen und konvergenten zellulären Oxidationswege in gewissem Maße unspezifisch sind, stimmt es mit früheren Beobachtungen überein, dass die Mitochondrien ein therapeutisches Ziel von PDT40 sind. Wichtig ist, dass die Lebensfähigkeit bei Y-90-Aktivitäten, die in vitro allein für beide HCC-Zelllinien nicht toxisch waren, deutlich verringert war. Diese niedrige Aktivität (0,1–0,2 MBq/0,2 ml) entspricht unter Annahme des MIRD-Modells etwa 25–50 Gy und liegt deutlich unter dem klinisch für tumortragende Lebervolumina vorgeschriebenen Wert. Mit dem Potenzial der selektiven Abgabe und Internalisierung von Nano-Photosensibilisatoren an Tumorzellen in vivo kann dies zu einer tumoriziden Wirkung in Bereichen führen, die aufgrund der Heterogenität der Mikrokügelchenablagerung niedrigere Y-90-Dosen erhalten, oder bei Patienten, die aufgrund von Mikrokügelchenablagerungen keine höheren Dosen erhalten können höheres Risiko für Hintergrundtoxizitäten in der Leber oder ungünstigere Gefäßkanäle41. Darüber hinaus wird ein erhöhter SNU-387-Zelltod bei Y-90-Aktivitäten von bis zu 0,75 MBq/0,2 ml beobachtet, was nach dem MIRD-Modell ungefähr 170 Gy entspricht, ebenfalls unterhalb der absorbierten Dosis des perfundierten Lebervolumens, die für ablative Zwecke in HCC7 berücksichtigt wurde ,8,42. Daher könnte die Implementierung von TiO2-Tf-TC oder anderen Nano-Photosensibilisatoren, die eine Tumorretention zeigen, möglicherweise diese ablative Dosisschwelle für HCC senken und möglicherweise eine erhöhte Aktivität gegen Tumoren zeigen, die höhere Dosen für die Reaktion erfordern12. Wichtig ist, dass die Zugabe von TiO2-Tf-TC weder den oxidativen Stress noch den Zelltod in normalen menschlichen Hepatozyten erhöhte. Zusammen mit dem günstigen Bioverteilungsprofil von TiO2-Tf-TC, das in früheren Arbeiten gezeigt wurde und eine minimale Ablagerung außerhalb der Ziellunge oder Hintergrundleber zeigt, gehen wir davon aus, dass die Wahrscheinlichkeit gering ist, dass diese neuartige Behandlungsstrategie das Toxizitätsprofil von Y-9018 erhöhen würde.

Wir haben bei der gut differenzierten HepG2-Zelllinie keinen signifikanten Anstieg der zellulären ROS-Produktion und Zytotoxizität durch Zugabe von Nano-Photosensibilisatoren bei höheren Aktivitäten von Y-90 (über 0,2 MBq/0,2 ml) beobachtet, was im Gegensatz zu dem steht, das bei der schlecht differenzierten Zelllinie beobachtet wurde SNU-387-Zelllinie. HepG2-Zellen reagierten jedoch empfindlicher auf die zytotoxischen Wirkungen von Y-90 allein als SNU-387-Zellen. Diese beiden Beobachtungen könnten darauf hindeuten, dass durch die Einführung von Zusatztherapien wie Nano-Photosensibilisatoren in der empfindlicheren HepG2-Zelllinie möglicherweise weniger Raum für therapeutische Verbesserungen besteht. Während diese Ergebnisse in einer größeren Anzahl von Proben bestätigt werden müssen, haben begrenzte klinische Daten gezeigt, dass Patienten mit schlechter differenzierten histologischen HCC-Tumoren, wie durch Dual-Tracer-FDG/C-11-Acetat-Positronenemissionstomographie (PET)/CT angezeigt, auftraten schlechtere Ansprechraten und Überleben nach Y-90-Radioembolisierung als ihre gut differenzierten Gegenstücke12. Der erhöhte oxidative Stress und die erhöhte Zytotoxizität von schlecht differenzierten SNU-387-Zellen mit Nano-Photosensibilisatoren weisen darauf hin, dass diese neuartige Zusatztherapie bei bestimmten histologischen Subtypen, die möglicherweise bereits einen dringenden Bedarf an zusätzlichen Therapieoptionen haben, einen größeren therapeutischen Nutzen haben könnte. Diese Ergebnisse und die erhebliche genetische Heterogenität von HCC erfordern auch die sorgfältige Gestaltung von In-vivo-Studien unter Verwendung verschiedener orthotopischer Tiermodelle und von Patienten stammender Xenotransplantate mit unterschiedlichem bösartigen Potenzial und genetischen Profilen, um zu ermitteln, welche Patientenkohorten davon profitieren könnten43. Dies wird für die ordnungsgemäße Information und Gestaltung klinischer Studien von entscheidender Bedeutung sein.

Im Hinblick auf die Implementierung einer tiefenunabhängigen PDT mit Y-90 ist die Verwendung seiner Mikrosphärenform (SirSpheres) von Vorteil, da diese bereits weltweit in der Klinik weit verbreitet ist, wodurch die oft kostspielige und aufwendige Innovation und Neuübersetzung der Beta-emittierenden Quelle vermieden wird Radiochemie. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Aktivierung von Nano-Photosensibilisatoren dann erreicht wird, wenn Y-90 höchstwahrscheinlich extrazellulär verbleibt (mittlerer SirSphere-Durchmesser 35 μm, wobei Y-90 dauerhaft in die Harzmikrosphäre eingebettet ist und ein Auslaugen verhindert), was wahrscheinlich auf seine hohe Zerfallsenergie zurückzuführen ist (Mittelwert 0,94 MeV, Maximum 2,28 MeV) und Beta-Minus-Partikel-Gewebepenetration von 2–11 mm (Mittelwert 2,5 mm)44. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, Y-90 für die Internalisierung in Krebszellen neu zu formulieren, was wahrscheinlich erforderlich ist, um die Aktivierung von Nano-Photosensibilisatoren mit anderen Radionukliden mit niedrigerer Energie oder Penetranz zu ermöglichen18. Daher können sich klinische Übersetzungsbemühungen auf die Formulierung von Nano-Photosensibilisatoren konzentrieren und leichter mit dem klinischen Arbeitsablauf weit verbreiteter Y-90-Mikrokügelchen entweder in Harz- oder Glasform kombiniert werden. Die Verwendung von TiO2 und TC als Nano-Photosensibilisatoren ist vorteilhaft, da beide Licht im UV-Bereich absorbieren, wo die Cerenkov-Emission am höchsten und effizientesten ist, und ersteres weniger anfällig für Photobleichung ist, die bei organischen Photosensibilisatoren beobachtet wird45,46,47,48. Darüber hinaus ist TiO2 ein Photosensibilisator, der zur regenerativen Produktion von Hydroxyl- und Singulett-Sauerstoffradikalen fähig ist18,49. Dieser Effekt kann durch Bestrahlung von TiO2 mit UV-Spektrumsstrahlung im Bereich von 250–350 nm ausgelöst werden, die durch die Cerenkov-Emission beim Y-90-Zerfall erzeugt wird. Die relative Häufigkeit von Singulett-Sauerstoff- und Hydroxylradikalen hängt von der Größe des TiO2-Nanopartikels und der Verfügbarkeit von O2 ab, wobei Hydroxyl in einer hypoxischen Umgebung bevorzugt ist50. Unser Nachweis einer gesteigerten ROS-Produktion mit einer Vielzahl von Photosensibilisatoren, einschließlich des natürlich vorkommenden und klinisch verwendeten Hypericin (Abb. 2A und 3A), rechtfertigt jedoch die Erforschung zusätzlicher Nano-Photosensibilisator-Formulierungen. Im Einklang mit früheren Arbeiten wird TiO2-Tf-TC in vitro in HCC-Zellen internalisiert, wo PDT wahrscheinlich am wirksamsten ist und letztendlich die tumorizide Aktivität von Y-90-Mikrokügelchen räumlich verstärken kann18,51,52. Es sind jedoch Studien zur Untersuchung der Aufnahme und Retention von Nano-Photosensibilisatoren über einen ausreichenden Zeitraum des Y-90-Zerfalls in klinisch relevanten orthotopischen In-vivo-Modellen von HCC erforderlich.

Die Verwendung und Handhabung von Y-90-Mikrosphären (SirSpheres) für In-vitro-Experimente stellt aufgrund ihrer hohen Energierisiken, Heterogenität und Mikrosphärenablagerung erhebliche logistische Herausforderungen dar und erfordert spezielle Ausrüstung und Strahlenschutzgenehmigungen. Diese Gefahren erwiesen sich für bestimmte Tests, die Lumineszenz bei höheren Y-90-Aktivitäten und Durchflusszytometrie beinhalteten, als unerschwinglich und stellten eine Herausforderung für Mikroskopiestudien dar, da das Y-90 vor der Analyse vollständig zerfallen musste (länger als 30 Tage). Das Absetzen und die Heterogenität der Mikrokügelchen wurden kontrolliert, indem die Hintergrundlumineszenz jeder Versuchsbedingung für Zellstudien bestimmt und auf eine mit Y-90-Cl3 erstellte Standardlumineszenz-Aktivitäts-Kurve normalisiert wurde. Die stets vorhandene räumliche Heterogenität von Y-90-Mikrokügelchen unter unseren Versuchsbedingungen spiegelt jedoch die gängigen Arbeitsannahmen der Mikrokügelchen-Mikrodosimetrie in der aktuellen Praxis wider14.

Die In-vitro-Daten in dieser Studie liefern Motivation, die Y-90-Mikrosphärenaktivierung von Nano-Photosensibilisatoren in klinisch relevanten In-vivo-HCC-Modellen zu untersuchen. Angesichts der unterschiedlichen Wirkungen in zwei HCC-Zelllinien mit unterschiedlichem bösartigem Potenzial und unterschiedlicher Krebsätiologie sollten In-vivo-Modelle mit aggressiveren Tumorsubtypen und vom Patienten stammende Xenotransplantate ähnlicher Natur, die möglicherweise resistenter gegen die Y-90-Therapie sind, Vorrang haben. Da die Verabreichung von Y-90-Mikrosphären über die Leberarterie bei Kleintieren ressourcenintensiv und technisch äußerst anspruchsvoll ist, ist die Auswahl des richtigen und aussagekräftigsten In-vivo-Modells von entscheidender Bedeutung. Diese Bemühungen dauern an. Während wir in vitro einen erhöhten zellulären oxidativen Stress und Tod in HCC-Zellen im Vergleich zu Y-90-Mikrokügelchen allein zeigten, war dieser Unterschied im Vergleich zu dem, der in unseren zellfreien Medienergebnissen beobachtet wurde, und im Vergleich zu Positronen-Beta-emittierenden Radionukliden, die dies nicht zeigten, bescheidener Zytotoxizität bei relevanten Aktivitäten allein in anderen Studien18,20,22,23. Wir gehen jedoch davon aus, dass die therapeutischen Wirkungen von Y-90-Mikrokügelchen in Kombination mit Nano-Photosensibilisatoren in vivo und in der Klinik aufgrund der mehrdimensionalen tumoriziden Mechanismen der PDT, wie z in In-vitro-Experimenten erfasst19. Darüber hinaus haben wir keine Unterschiede in den Zelltodmechanismen oder Signalwegen zwischen Y-90-Mikrosphären allein oder in Kombination mit Nano-Photosensibilisatoren untersucht, was in In-vivo-HCC-Modellen wahrscheinlich aufschlussreicher wäre.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Stimulation von Nano-Photosensibilisatoren durch Y-90-Mikrokügelchen zu einer deutlichen Steigerung der ROS-Produktion in zellfreien Medien führte, was wiederum zu erhöhtem oxidativen Stress und Zelltod in hochmalignen SNU-387-HCC-Zellen im Vergleich zu Y-90-Mikrokügelchen allein führte . Wir gehen davon aus, dass diese therapeutischen Wirkungen aufgrund der mehrdimensionalen tumoriziden Mechanismen der PDT in vivo und in der Klinik noch deutlicher sichtbar werden, mit dem ultimativen Ziel, die Y-90-Radioembolisierung bei HCC und anderen Lebertumoren zu verbessern. Darüber hinaus können die Tumorpenetration und die intrazelluläre Aufnahme von TiO2-Tf-TC-Nano-Photosensibilisatoren die räumlich-zeitliche tumorizide Aktivität von Y-90-Mikrokügelchen verbessern. Anwendungen in klinisch relevanten In-vivo-HCC-Modellen sind im Gange.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Jose Garcia, MS für Radioonkologie, und Daniel Szatkowski für Strahlensicherheit für die Unterstützung bei der Handhabung und dem Transfer von SirSphere sowie Terence Gade MD, PhD für die großzügige Spende von SNU-387-Zellen. Wir danken Greg Williams für seine Unterstützung beim Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die Research Scholar (RSCH2115) und Seed (RS6409) Grants der Research and Education Foundation der Radiological Society of North America (RSNA) finanziert.

Abteilung für Radiologie, Mallinckrodt Institute of Radiology, Washington University School of Medicine, 4515 McKinley Ave., Etage 2, St. Louis, MO, 63110, USA

Christopher D. Malone, Christopher Egbulefu, Alexander Zheleznyak, Jahnavi Polina, Partha Karmakar, Kvar Black, Monica Shokeen und Samuel Achilefu

Abteilung für Biomedizintechnik, Washington University in St. Louis, St. Louis, MO, USA

Monica Shokeen & Samuel Achilefu

Abteilung für Biochemie und Molekulare Biophysik, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Samuel Achilefu

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CM, CE, KB und SA konzipierten das Forschungskonzept und das experimentelle Design. CM, CE, JP, PK und KB führten die Experimente durch. CM, CE, JP, AZ, KB, MS und SA analysierten und überprüften die Daten. CM hat das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und überarbeitet.

Korrespondenz mit Christopher D. Malone.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Malone, CD, Egbulefu, C., Zheleznyak, A. et al. Aktivierung von Nano-Photosensibilisatoren durch Y-90-Mikrokügelchen zur Verstärkung von oxidativem Stress und Zelltod bei hepatozellulärem Karzinom. Sci Rep 12, 12748 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17185-0

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Eingegangen: 27. April 2022

Angenommen: 21. Juli 2022

Veröffentlicht: 26. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17185-0

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