Automatisierte Zelle

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19873 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Ziel dieser Studie war es, lebende Zellen automatisch anhand ihres Zelltyps zu klassifizieren, indem die Muster rückgestreuter Signale von Zellen analysiert wurden, die nur minimale Auswirkungen auf die normale Zellphysiologie und -aktivität haben. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die markierungsfreie akustische Erfassung mittels hochfrequentem Ultraschall bei einer hohen Pulswiederholungsfrequenz (PRF) ein einzelnes Objekt aus einer heterogenen Probe erfassen und analysieren kann. Es ist jedoch von entscheidender Bedeutung, mögliche Fehler bei der manuellen Einstellung und zeitaufwändige Prozesse bei der Nachbearbeitung der integrierten Rückstreukoeffizienten (IB) von Rückstreusignalen zu eliminieren. In dieser Studie wird ein automatisiertes Zelltyp-Klassifizierungssystem vorgeschlagen, das eine markierungsfreie akustische Erfassungstechnik mit Deep-Learning-gestützten Modellen der künstlichen Intelligenz kombiniert. Wir verwendeten einen eindimensionalen (1D) Faltungs-Autoencoder, um die Signale zu entrauschen, und führten eine Datenerweiterung auf Basis der Gaußschen Rauschinjektion durch, um die Robustheit des vorgeschlagenen Klassifizierungssystems gegenüber Rauschen zu verbessern. Anschließend wurden entrauschte Rückstreusignale mithilfe von Convolutional Neural Network (CNN)-Modellen für drei Arten von Signaldatendarstellungen in bestimmte Zelltypen klassifiziert, darunter 1D-CNN-Modelle für die Wellenform- und Frequenzspektrumanalyse und zweidimensionale (2D) CNN-Modelle für die Spektrogrammanalyse. Wir bewerteten das vorgeschlagene System, indem wir zwei Arten von Zellen (z. B. RBC und PNT1A) und zwei Arten von Polystyrol-Mikrokügelchen klassifizierten, indem wir ihre rückgestreuten Signalmuster analysierten. Wir haben versucht, zellphysikalische Eigenschaften zu entdecken, die sich in rückgestreuten Signalen widerspiegeln, indem wir experimentelle Variablen wie Durchmesser und Strukturmaterial kontrollierten. Wir haben die Wirksamkeit der neuronalen Netzwerkmodelle und die Wirksamkeit der Datendarstellungen weiter bewertet, indem wir ihre Genauigkeit mit der der Basismethoden verglichen haben. Daher kann das vorgeschlagene System zur zuverlässigen und präzisen Klassifizierung verschiedener Zelltypen mit unterschiedlichen intrinsischen physikalischen Eigenschaften für die Entwicklung personalisierter Krebsmedikamente verwendet werden.

Die Zelltrennung aus einem heterogenen Zellgemisch ist für die Krebsforschung und die Entwicklung neuer personalisierter Medikamente von entscheidender Bedeutung1,2,3,4,5,6,7. Die präzise Isolierung verschiedener Zelltypen ermöglicht ein besseres Verständnis der Zellfunktionen und -rollen in biologischen Systemen und ermöglicht die Identifizierung spezifischer Zellpopulationen, die am Krankheitsverlauf und an der Behandlungsreaktion beteiligt sind1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Auf der Grundlage von Zelloberflächenmarkern wie Fluoreszenzfarbstoffen13,14,3.0.co;2-l (1999) wurden Techniken zur Zelltrennung entwickelt. id="ref-link-section-d9538225e490">15 und spezifische Antikörper16,17 oder intrinsische physikalische Zelleigenschaften, einschließlich Größe, Dichte und Kompressibilität18,19,20,21. Zu diesen Techniken zählen Methoden zur markierungsfreien Zellsortierung, die auf basieren Intrinsische physikalische Biomarker werden häufig verwendet, da sie keine intensiven Aufgaben oder spezifischen Zelloberflächenmarkierungen erfordern, um die Zellen von Interesse zu identifizieren. Daher können unerwünschte Nebenwirkungen auf die normale Zellphysiologie und -aktivität im Vergleich zu denen der herkömmlichen markierungsgestützten Zellsortierung minimiert werden Methoden wie die fluoreszierend aktivierte Zellsortierung und die magnetisch aktivierte Zellsortierung. 18, 19. Ansätze wie optische Pinzetten und mikrofluidische Plattformen können Zellen effektiv und zuverlässig trennen. Diese Methoden leiden jedoch unter kritischen Einschränkungen wie dem photothermischen Effekt bei der Verwendung von eine starke Lichtintensität, schwierige Techniken und unerwünschte Auswirkungen von Scherbeanspruchung, Haftreibung und Blockade auf Zellfunktionen und -reaktionen aufgrund struktureller Unregelmäßigkeiten innerhalb von Mikrostrukturen20,21,22,23.

Kürzlich wurde gezeigt, dass ultraschallbasierte akustische Pinzetten in der Lage sind, einzelne Zellen zu erfassen oder physikalische Zelleigenschaften als Rückstreukoeffizienten mit einem relativ einfachen und kostengünstigen Versuchsaufbau zu messen24,25,26,27. Längere Ultraschallimpulse und darauffolgende kurze Impulse sind erforderlich, um rückgestreute Signale von der eingeschlossenen Einzelzelle sicher zu manipulieren bzw. zu erfassen, wobei für jedes Verfahren entweder derselbe Wandler oder unterschiedliche Wandler verwendet werden. Eine präzise Messung in einer eingeschlossenen Einzelzelle ist jedoch eine Herausforderung, da neben den Versuchsaufbauten zwangsläufig zwei unterschiedliche Pulssequenzen verwendet werden, was zu irreführenden Informationen führen kann. Um dieser kritischen Einschränkung zu begegnen, wurden akustische Pinzetten mit hochfrequentem Ultraschall und einer hohen Pulswiederholungsfrequenz (PRF) entwickelt, um gleichzeitig eine gezielte einzelne Zelle einzufangen und ihre rückgestreuten Signale zu messen28. Monozyklische Ultraschallimpulse mit hoher PRF sind in der Lage, eine einzelne Zielzelle einzufangen, wobei die akustische Einfangkraft im Vergleich zu herkömmlichen akustischen Pinzetten mit übermäßiger akustischer Energie und längeren Impulsen geringer ist. Darüber hinaus können sie gleichzeitig die von den eingefangenen Objekten im Mikrometerbereich zurückgestreuten Signale messen, um zwei unterschiedliche Mikrokügelchendurchmesser, beispielsweise 5 und 10 µm, und zwei unterschiedliche Zelldurchmesser, einschließlich roter Blutkörperchen (RBCs), zu identifizieren ) mit Durchmessern zwischen 6 und 8 µm und normalen SV40 immortalisierten epithelialen Prostatazellen (PNT1A) mit Durchmessern zwischen 9 und 11 µm, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Allerdings ist die Nachbearbeitung der integrierten Rückstreukoeffizienten (IB) basierend auf gemessenen Rückstreusignalen typischerweise ein zeitaufwändiger Prozess und verursacht mögliche Fehler aufgrund der manuellen Einstellung der reflektierten Signalzeit zwischen dem ersten und dem winzigen reflektierten Ultraschallsignal, das vom eingefangenen einzelnen Objekt erzeugt wird . Darüber hinaus stammt das große reflektierte Ultraschallsignal von der dünnen Mylar-Folie, da der IB-Koeffizient als das Verhältnis der von einem Streuvolumen zurückgestreuten Energie zu der von einem flachen Quarzziel definiert ist. Um die durch die manuelle Analyse verursachten Einschränkungen zu überwinden, werden in dieser Studie Deep-Learning-gestützte Modelle der künstlichen Intelligenz eingesetzt, um die Nachbearbeitung zu minimieren.

Zur Analyse der Eigenschaften lebender Zellen können verschiedene Ansätze verwendet werden, darunter heuristische manuelle Analysen, herkömmliche Methoden des maschinellen Lernens (ML) und Deep-Learning-Modelle. Erstens sind heuristische Ansätze einfach und intuitiv, weisen jedoch inhärente Einschränkungen auf. Darüber hinaus verfügen herkömmliche ML-Algorithmen nicht über ausreichende Fähigkeiten, um Korrelationen von Zelleigenschaften mit beobachteten Daten auszudrücken. Schließlich verfügen hochmoderne (SOTA) Deep-Learning-Modelle über hohe Ausdrucksfähigkeiten, erfordern jedoch eine große Menge an Trainingsdaten, die aus lebenden Zellen nur schwer zu sammeln sind. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass relativ flache Convolutional Neural Network (CNN)-Modelle eine effektive und effiziente Lösung29,30 sein können, um die physikalischen Eigenschaften von Zellen, wie z. B. Zellsteifigkeit und Struktur der Zellmembran, durch den Vergleich ihrer vorherigen mikroskopischen Bilder zu untersuchen und nach Einwirkung des hochfrequenten Ultraschallstrahls. Unter Verwendung von VGG (Visual Geometry Group)-ähnlichen31 CNN-Modellen als Rückgrat wurden Brustkrebszellen erfolgreich auf der Grundlage ihrer Invasivität klassifiziert und mit hoher Genauigkeit an die Young-Module von Zellen angenähert. Inspiriert durch unsere früheren Studien konzentrierten wir uns darauf, festzustellen, ob Modelle neuronaler Netzwerke einzelne Objekte in Mikrometergröße anhand von Mustern rückgestreuter Signale von Zielobjekten identifizieren und trennen können.

In dieser Studie schlagen wir einen Ansatz zur automatisierten Klassifizierung von Zelltypen vor, indem wir einige Aspekte der aktuellen Nachverarbeitungspipeline verbessern, zusammen mit der markierungsfreien akustischen Erfassung eines eingeschlossenen einzelnen Objekts. Unsere CNN-Modelle können zellphysikalische Eigenschaften durch die Analyse rückgestreuter Signale ermitteln. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass die CNN-Modelle robust gegenüber Rauschen bei Rohsignalen sind, beispielsweise bei Signalen, die von umgebenden Objekten reflektiert werden. Für die Experimente sammelten wir rückgestreute Signale mit einem markierungsfreien Einzelzellanalysesystem28, entrauschten die rohen rückgestreuten Signale mit CNN-Autoencodern und klassifizierten Zellen in ihre Zelltypen, indem wir die entrauschten Signale mit CNN-Backbones und vollständig verbundenen neuronalen Netzen analysierten.

Obwohl eine frühere Studie28 gezeigt hat, dass Zelldurchmesser ihre Rückstreusignale beeinflussen, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu untersuchen, wie andere Zellaspekte zu Unterschieden in den Rückstreusignalen führen können. Daher haben wir versucht, andere Zelleigenschaften aufzudecken, die rückgestreute Signale beeinflussen, und herauszufinden, ob neuronale Netzwerkmodelle diese Eigenschaften erfassen können. Die entrauschten Signale wurden in Wellenformsignale, Fourier-Spektren und Spektrogramme umgewandelt. Anschließend verwendeten wir die vorgeschlagenen CNN-Backbones, um Merkmale im Zeit-, Frequenz- und Zeit-Frequenz-Bereich aus den transformierten Signalen zu extrahieren. Da sich jedes Rückgrat auf die jeweiligen Merkmale rückgestreuter Signale konzentriert, können wir die Art der Zelleigenschaften annehmen, die Unterschiede in den Signaleigenschaften verursachen, indem wir die Leistung der Rückgrate bei der Klassifizierung von Zellen und Polystyrol-Mikrokügelchen nach ihren Typen und physikalischen Eigenschaften untersuchen. Daher haben wir das vorgeschlagene System anhand der folgenden Forschungsfragen bewertet:

RQ 1. Zellen weisen je nach Typ unterschiedliche Muster rückgestreuter Signale auf;

RQ 2. Die Analyse des Frequenzspektrums ist nützlich, um die Eigenschaften rückgestreuter Signale zu ermitteln.

RQ 3. Zeitliche Änderungen in den Frequenzspektren sind für die Analyse der Muster rückgestreuter Signale von Bedeutung.

RQ 1 wurde durch die Leistung der vorgeschlagenen neuronalen Netzwerkmodelle für die automatisierte Zelltypklassifizierung validiert (Tabelle 1). Wir haben detailliertere Experimente durchgeführt, um die Zelleigenschaften zu untersuchen, die die rückgestreuten Signale wie folgt beeinflussen: Unterscheidung von (1) Zelltypen mit unterschiedlichen Durchmessern (Tabelle 1), (2) Polystyrol-Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Durchmessern (Tabelle 2) und (3) Mikrometern -große Objekte mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften und ähnlichen Durchmessern (Tabelle 3). Wir haben RQ 2 verifiziert, indem wir die Leistung der Zeitbereichsanalyse (d. h. Anwendung von eindimensionalem (1D) CNN auf Rohsignale) mit der der Frequenzbereichsanalyse verglichen haben (Tabellen 1, 2, 3). Darüber hinaus haben wir das Spektrogramm mit Frequenzspektrumanalysen verglichen, um RQ 3 zu validieren (Tabellen 1, 2, 3 und Abb. 5). Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Rauschen die Leistung der vorgeschlagenen Modelle erheblich beeinträchtigt und mithilfe von Ablationstests behoben werden sollte (Tabelle 4).

Der Rest dieses Papiers ist wie folgt gegliedert. Der Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschreibt das markierungsfreie Einzelzellanalysesystem, das zum Sammeln von Rückstreusignalen von lebenden Zellen verwendet wird, das vorgeschlagene Autoencoder-Modell zum Entrauschen roher Rückstreusignale und die vorgeschlagenen CNN-Backbones zur Entdeckung von Zelleigenschaften aus Rückstreusignalen. Im Abschnitt „Ergebnisse“ stellen wir experimentelle Verfahren und Ergebnisse vor, um das vorgeschlagene Klassifizierungssystem zu bewerten und unsere Forschungsfragen zu validieren. Die Diskussion, abschließende Bemerkungen und zukünftige Forschungsrichtungen werden im Abschnitt „Diskussion und abschließende Bemerkungen“ vorgestellt.

Rückgestreute Signale von zwei Zelltypen (PNT1A und RBC) und Polystyrol-Mikrokügelchen (5 \(\upmu\)m und 10 \(\upmu\)m) wurden mit einem markierungsfreien Einzelzellanalysesystem gesammelt28. Wir haben den Rauschunterdrückungs-Autoencoder und die auf künstlichen neuronalen Netzen basierenden Klassifizierer angewendet, um unsere Annahme zu bestätigen, dass das rückgestreute Signal sich bei der Unterscheidung bestimmter Zelltypen von anderen deutlich unterscheidet. Die rückgestreuten Signale wurden durch das vorgeschlagene Autoencoder-Modell entrauscht, und unsere CNN-Klassifikatoren wurden darauf trainiert, Zelleigenschaften aus der Zeitbereichs- oder Frequenzbereichsanalyse zu ermitteln.

Abbildung 1a zeigt den Versuchsaufbau für die markierungsfreie Isolierung und Analyse einzelner Zellen, bestehend aus einem speziell angefertigten, eng fokussierten Hochfrequenz-Ultraschallwandler, der mit seinem Impedanzanpassungsnetzwerk betrieben wird, sowie einem speziell angefertigten Front-End-System, einem dreidimensionalen (3D). ) Lineartisch, ein Oszilloskop und ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einem Bilderfassungs- und Analysetool28. Der auf Lithiumniobat (\(LiNbO_3\)) basierende hochfokussierte Hochfrequenzwandler mit einer Aperturgröße von 2,6 mm und einer Fokuszahl von 0,75 wurde gemäß dem Wandlerherstellungsprozess32 entworfen und hergestellt. Das anschließbare Impedanzanpassungsnetzwerk wurde entwickelt, um die Effizienz der Energieübertragung zwischen dem Wandler und dem speziell angefertigten Front-End-System zu maximieren33. Die Position des speziell angefertigten Hochfrequenzwandlers mit dem Impedanzanpassungsnetzwerk wurde durch einen 3D-Lineartisch (SGSP 20, Sigma KOKI Co., Japan) präzise eingestellt, der von einem maßgeschneiderten LabVIEW-Programm (National Instruments, Austin, TX, USA) gesteuert wurde . Ein maßgeschneidertes Front-End-System, das auf einer kompakten und kostengünstigen Leiterplatte (PCB) entwickelt wurde, bestand aus einem Sender zur Erzeugung von Hochfrequenz (\(\ge 100\) MHz) und hoher PRF (\(\ 1\) MHz) monozyklische bipolare Impulse, ein Empfänger mit einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis zur Verstärkung erheblich schwacher Rückstreusignale und ein diodenbasierter Expander und Begrenzer zum Schutz des Senders bzw. des Empfängers bei 28, 100 MHz) Ultraschallanwendungen. in Proceedings of the 2013 IEEE International Ultraschallsymposium (IUS 2013), 1567–1570. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2013.0399 (IEEE, Prag, Tschechische Republik, 2013).“ href="#ref-CR34" id="ref-link-section-d9538225e3910">34,35,36 Die rückgestreuten Signale des eingefangenen einzelnen Objekts auf der akustisch transparenten Mylar-Folie wurden mit einer Abtastrate von 10 GHz unter Verwendung des Oszilloskops (104MXi, LeCroy, Santa Clara, CA, USA) und des inversen Fluoreszenzmikroskops (IX71, Olympus, Center Valley) aufgezeichnet , PA, USA) mit dem Bilderfassungs- und Analysetool (Metamorph, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) wurden verwendet, um zeitaufgelöste Hellfeldbilder zu erfassen, um das durch hochfrequente Ultraschallimpulse induzierte Einfangen und Bewegen einzelner Objekte wie z als Teilchen oder Zelle.

Markierungsfreies Einzelzell-Trenn- und Analysesystem. (a) Versuchsaufbau bestehend aus einem Hochfrequenz-Ultraschallwandler mit Impedanzanpassungsnetzwerk, einem maßgeschneiderten Front-End-System, einem dreidimensionalen Lineartisch und einem Oszilloskop sowie einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einem Bilderfassungs- und Analysetool. (b) Gemessene Pulswellenform und ihr Spektrum des speziell angefertigten Front-End-Systems. (c) Gemessene Puls-Echo-Wellenform und ihr Spektrum eines Hochfrequenz-Ultraschallwandlers mit Impedanzanpassungsnetzwerk. (d–f) Gemessene räumliche Ultraschalldrücke des Hochfrequenz-Ultraschallwandlers mit Impedanzanpassungsnetzwerk.

Abbildung 1b stellt die gemessene Leistung des Front-End-Systems dar, das monozyklische bipolare Impulse mit einer Mittenfrequenz von 200 MHz und einer \(-6\) dB-Bandbreite von 110–290 MHz erzeugen kann. Die Leistung des entwickelten Hochfrequenz-Ultraschallwandlers mit seinem Impedanzanpassungsnetzwerk wurde durch eine Puls-Echo-Antwort mit einem flachen Quarz und einer Drahtphantom-Bildgebung mit einem Wolframdraht mit 2,5 µm Durchmesser in entgastem und entionisiertem Wasser gemessen . Aus der Impuls-Echo-Antwort in Abb. 1c ergibt sich, dass die gemessene Mittenfrequenz und die \(-6\) dB-Bandbreite des Hochfrequenz-Ultraschallwandlers mit dem Impedanzanpassungsnetzwerk 153 MHz bzw. 144–162 MHz betrugen. Die gemessenen axialen und lateralen Abmessungen des Wandlerfokus betrugen 28,5 bzw. 8,6 \(\upmu\)m, definiert durch die Halbwertsbreite (FWHM, \(-6\) dB Druck) des Druckfeldes basierend auf das Drahtzielbild, wie in Abb. 1d–f dargestellt.

Darüber hinaus wurde in Abb. 2 die Fähigkeit von Monozyklus-Ultraschallimpulsen bei hoher PRF zum Einfangen einzelner Zielobjekte demonstriert. Das akustische Einfangkraft-Kalibrierungssystem wurde mit einem Druckregler (ez-gSEAL 100B, Neobiosystem, CA, USA), einem Glas, entwickelt Kapillare mit Filament (GD-1, Narishige, NY, USA) und einem vertikalen Mikropipettenzieher (PC-10, Narishige, NY)37,38,39. Gemessene akustische Einfangkraft von \(122,4 \pm 13,4\) nN (\(n = 3\)), erzeugt durch monozyklische elektrische Impulse mit einer Impulslänge von 6,7 ns und einer angelegten Eingangsspannung von 50 V bei einer PRF von 167 kHz, die gleichzeitig aktiviert wurde Erfassen und bewegen Sie Mikrosphären, Erythrozyten und PNT1A-Zellen entlang der Richtung des Wandlers und erfassen Sie rückgestreute Signale vom eingefangenen Einzelobjekt.

Akustisches Einfangen von (a–c) der gezielten einzelnen Polystyrol-Mikrokugel, (d–f) Erythrozyten und (g–i) PNT1A-Zelle mit Bewegung des Hochfrequenz-Ultraschallwandlers. Gelbe und rote gestrichelte Kreise geben die ursprüngliche bzw. verschobene Position des Wandlers an. Maßstabsbalken in den Bildern zeigen (a–c) 100 \(\upmu\)m und (d–i) 20 \(\upmu\)m an.

Es wurden frische menschliche Blutproben von gesunden Freiwilligen entnommen, die eine Einverständniserklärung vorlegten. Alle Experimente mit dem gewonnenen Blut wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Institutional Review Board (IRB) der University of Southern California (UP-16-00713) genehmigt wurden. Das gesammelte Vollblut wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bei 500 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Erythrozyten abzutrennen. Nach vorsichtigem Entfernen des Überstands wurden die Erythrozyten in PBS erneut zentrifugiert und in einer gemischten Lösung aus PBS und Alsever-Lösung resuspendiert. PNT1A-Zellen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), kultiviert in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, wurden als Monoschicht in einem Inkubator bei 37 °C und befeuchtetem Raum gezüchtet Atmosphäre von 5\(\%\) CO\(_2\). Die PNT1A-Zellen wurden zweimal vorsichtig mit PBS gewaschen, 5 Minuten lang in einem Inkubator mit TrypLE-Lösung versetzt und 5 Minuten lang bei 150\(\times\)g zentrifugiert, um sie zu trennen. Nach vorsichtigem Entfernen des Überstands wurden die PNT1A-Zellen in PBS erneut zentrifugiert und in Dulbecco-PBS mit Ca\(^{2+}\) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) resuspendiert.

Da es schwierig war, die von Zellen zurückgestreuten Signale innerhalb von Signalen von umgebenden Objekten wie Mylar-Filmen genau zu erfassen, führten wir zunächst den Prozess der Rückgewinnung von rückgestreuten Signalen von Zellen durch, die unter Reflexionen von anderen umgebenden Objekten verborgen waren. In jüngster Zeit wurden in großem Umfang Autoencoder-Modelle zur Rauschunterdrückung eingesetzt, um dieses Problem zu lösen40,41. Ein Autoencoder, eine künstliche neuronale Netzwerkarchitektur, komprimiert aus Eingabedaten extrahierte Merkmale in niedrigdimensionale Merkmalsvektoren (oder Matrizen/Tensoren) und stellt die ursprüngliche Eingabe aus den Merkmalsvektoren wieder her. Aufgrund der Dimensionalität der Merkmalsvektoren kann der Autoencoder nicht alle Details der Eingabe wiederherstellen, und in seiner Ausgabe verbleiben nur charakteristische Merkmale.

Rekurrente neuronale Netze (RNN)-Modelle, die die \(n+1\)-te Eingabe und die n-te Ausgabe berücksichtigen, um die \(n+1\)-te Ausgabe zu erzeugen, werden häufig zur Analyse sequenzieller Daten verwendet. Obwohl der RNN-Mechanismus beim Erlernen zeitlicher Korrelationen zwischen Eingabeproben effektiv ist, verursacht er auch eine inhärente Einschränkung, die als Langzeitabhängigkeitsproblem bezeichnet wird42. Aufgrund dieser Problematik werden frühere Eingaben weniger bevorzugt als spätere und schließlich vergessen. Da die Zelleigenschaften nicht in den letzten paar Proben rückgestreuter Signale widergespiegelt werden, sind Modelle erforderlich, die alle Proben zusammen analysieren können. Daher haben wir zur Rauschunterdrückung einen 1D-Faltungs-Autoencoder verwendet. Für jeden Abtastwert in den Signalen sammeln 1D-Faltungsoperationen Informationen über die zeitlich benachbarten Abtastwerte. Obwohl sich jeder Faltungsfilter auf den lokalen Kontext konzentriert, können wir die globalen Merkmale von Signalen extrahieren, indem wir die Faltungsschichten stapeln. Somit kann der 1D-Faltungs-Autoencoder die Einschränkungen des wiederkehrenden Autoencoders überwinden und eignet sich besser für sequentielle Daten als 2D-Faltungs- oder vollständig verbundene Autoencoder-Modelle. Darüber hinaus haben wir die erweiterte Faltung eingesetzt, um globale Merkmale aus den Signalen effizient zu ermitteln.

Erweiterte Faltungsschichten erweitern die Empfangsfelder herkömmlicher Operationen, die nur benachbarte Pixel oder Samples beobachten. Wenn also zwei zeitlich voneinander entfernte Proben Korrelationen aufweisen, benötigen wir zahlreiche Schichten, um Informationen von einer Probe zur anderen weiterzugeben. Eine erweiterte Faltung kann dieses Problem lösen, indem sie die Empfangsfelder von Faltungsoperationen erweitert. Durch die gleichzeitige Beobachtung größerer Bereiche konnten wir die Korrelationen zwischen entfernten Proben analysieren und gleichzeitig die Anzahl der Schichten reduzieren. Samal et al.43 schlugen ein 1D-Faltungs-Autoencoder-Modell vor, das Down-/Up-Sampling-Schichten durch Faltungsschichten ersetzt. Dieser Ansatz macht Empfangsfelder breiter, aber rechenintensiv. Unsere experimentellen Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass die aktuelle Anzahl an Parametern ausreicht, um die Eigenschaften rückgestreuter Signale von Zellen zu lernen.

Wie in Abb. 3a dargestellt, besteht der Encoder-Teil des vorgeschlagenen Autoencoder-Modells aus sechs erweiterten 1D-Faltungsschichten, drei Max-Pooling-Schichten und zwei vollständig verbundenen Schichten. Aus den vom Encoder erzeugten komprimierenden Merkmalsvektoren Z stellt der Decoder mithilfe von sieben erweiterten 1D-Faltungsschichten und drei Upsampling-Schichten die Originalsignale wieder her. Dies lässt sich wie folgt formulieren:

Dabei ist Decoder bzw. \(f(\cdot ;\cdot )\) und \(g(\cdot ;\cdot )\) repräsentieren den Encoder bzw. Decoder. Die Aktivierungsfunktion der Schichten im vorgeschlagenen Autoencoder war eine gleichgerichtete lineare Einheit (ReLU), und der mittlere absolute Fehlerverlust (MAE) und der Adam-Optimierer44 wurden zum Trainieren des Autoencoders verwendet. Abbildung 4a–d zeigt, dass der vorgeschlagene Autoencoder Hochfrequenzmerkmale in den Rohsignalen wiederherstellt. Allerdings trägt die alleinige Verwendung eines Entrauschungs-Autoencoders nicht wesentlich zur Genauigkeit der Zellklassifizierung bei, wie in Tabelle 4 gezeigt.

Strukturen der vorgeschlagenen CNN-Modelle. Das vorgeschlagene System besteht aus drei Hauptkomponenten: dem Hochfrequenz-Ultraschallwandler in Abb. 1, dem Entrauschungs-Autoencoder in (a) und CNN-Klassifikatoren in (b) und (c). Der Entrauschungs-Autoencoder reduziert Rauschen und betont latente Merkmale in rückgestreuten Signalen, die von den Hochfrequenz-Ultraschallwandlern erfasst werden. Die entrauschten Signale wurden durch FFT oder STFT verarbeitet. Bei der Wellenformanalyse haben wir keine zusätzliche Verarbeitung der entrauschten Signale durchgeführt. Anschließend werden die Signale (oder Spektren/Spektrogramme) als Eingaben für die CNN-Modelle verwendet, um Zellen nach Zelltyp zu klassifizieren.

Ergebnisse der vorgeschlagenen Entrauschungs-Autoencoder-Modelle. Die Abbildungen auf der linken Seite sind Spektrogramme einer PNT1A-Zelle und auf der rechten Seite sind Spektrogramme eines Erythrozyten zu sehen. Die X- und Y-Achse geben jeweils Zeit und Frequenz an. Darüber hinaus bezieht sich die Helligkeit der Farben auf die Intensität der Frequenzkomponenten. Die Zeiteinheit entspricht 16 Samples im Signal, und die Einheiten für Frequenz und Intensität sind Hz bzw. dB. (a) und (b) sind die aus dem Originalsignal extrahierten Spektrogramme, (c) und (d) basieren auf unserem Entrauschungs-Autoencoder unter Verwendung von 1D CNN und (e) und (f) sind Fälle, in denen der Entrauschungs-Autoencoder und Gauß Geräuschinjektion wurden zusammen verwendet.

Die Gaußsche Rauschinjektion kann die Robustheit des vorgeschlagenen Systems gegenüber Lärm und Umgebung auf der Stufe der Rauschunterdrückung und -klassifizierung verbessern45. Wie in Abb. 3a gezeigt, wird das ursprüngliche Signal X durch eine stochastische Abbildung \(\tilde{X} \sim q(\tilde{X} \mid \) mit Gaußschem Rauschen \(n \sim N(0, \sigma _n^2)\). Das beschädigte Signal wurde als Eingabedaten für den Encoder zum Extrahieren des Merkmals Z und zum Erhalten des rekonstruierten Entrauschungsergebnisses \(\hat{X}\) wie folgt verwendet:

Da Rauschen zufällig erzeugt wird, können wir außerdem die Anzahl der Eingangssignale erhöhen. Durch diesen Datenanreicherungsprozess kann der Autoencoder darauf trainiert werden, die charakteristischen Muster rückgestreuter Signale von redundantem Rauschen zu unterscheiden. Wir haben diese Erweiterungsmethode auf Rauschunterdrückung und Klassifikatoren angewendet. Abbildung 4 zeigt Beispiele von Rohsignalen, die von RBC- und PNT1A-Zellen gesammelt wurden, die Ergebnisse des vorgeschlagenen Autoencoders und Fälle, in denen Gaußsches Rauschen in die Eingänge des Autoencoders injiziert wird.

Diese Studie verwendete keine hochentwickelten neuronalen Netzwerkarchitekturen, um die rückgestreuten Signale von Zellen in Zelltypen zu klassifizieren. Trotz der hohen Leistung von SOTA-Deep-Learning-Modellen ist es eine Herausforderung, umfangreiche Daten zu sammeln, die zum Trainieren dieser Modelle aus lebenden Zellen erforderlich sind. Wie in unseren früheren Studien29,30 gezeigt, können relativ flache neuronale Netzwerkmodelle eine effiziente und effektive Lösung für die Analyse lebender Zellen mit einer begrenzten Datenmenge sein. Die Strukturen unserer CNN-Modelle ähneln denen von VGG1631, verwenden jedoch Techniken zur Erweiterung der Empfangsfelder und zur Verhinderung einer Überanpassung. Muster rückgestreuter Signale von Zellen waren mit bloßem Auge sowohl im Zeit- als auch im Frequenzbereichssignal nicht so deutlich sichtbar (Abb. 4). Die vorgeschlagenen CNN-Modelle stellten jedoch effektiv Muster wieder her, die unter Rauschen verborgen waren.

In VGG1631 verbessert die Festlegung der Größe des Faltungskerns auf \(3\times 3\) und die Erhöhung der Tiefe des Netzwerks die Klassifizierungsgenauigkeit. Die Durchführung mehrerer Faltungen mit einem kleinen Filter reduziert die Anzahl der Parameter im Vergleich zur Verwendung einiger Faltungsschichten mit großen Filtern. Durch diesen Ansatz konnten wir die Trainingseffizienz steigern und das Risiko einer Überanpassung verringern. Gleichzeitig konnte das CNN-Modell mit zunehmender Anzahl der Schichten nichtlineare Merkmale aus größeren Bereichen der Eingabedaten extrahieren.

Das Extrahieren von Merkmalen aus benachbarten Proben in den rückgestreuten Signalen führt jedoch zu Schwierigkeiten bei der Erfassung der globalen Eigenschaften der Signale. Um dieses Problem anzugehen, verbesserten Lu et al.46 die Glioma-Klassifizierungsleistung durch die Verwendung von ResNet47 mit erweiterter Faltung48, wodurch ein größeres Empfangsfeld erzielt werden kann, ohne die Größe der Faltungskerne zu erhöhen. Chen et al.49 schlugen eine Lungensegmentierungsmethode vor, die U-Net50 und dilatative Faltung in Computertomographiebildern (CT) kombiniert. Wir haben VGG-ähnliche Modelle, die mit erweiterter Faltung fusioniert sind, auf die rückgestreuten Signale der Zellen angewendet, um die Empfangsfelder der Faltungsfilter zu erweitern. Auf diese Weise haben wir Signalmerkmale erhalten, die sowohl die lokale als auch die globale Perspektive mit nur einer geringen Anzahl von Faltungsschichten und Parametern berücksichtigen.

Darüber hinaus änderte sich die Eingabeverteilung jeder Schicht, da die Parameter der vorherigen Schichten epochenbasiert aktualisiert wurden. Daher schwankte die Eingabeverteilung mit der Vertiefung der neuronalen Netzwerkmodelle erheblich, was das Parameterlernen instabil machte. Daher haben wir auf jede Schicht eine Batch-Normalisierung51 angewendet, die die Ausgabe der Schichten normalisiert, um die Lerngeschwindigkeit und -effizienz zu verbessern. Darüber hinaus haben wir die Regularisierung und Initialisierung von Gewichten, Bias und Dropout-Schichten eingesetzt, um die Trainingseffizienz zu erhöhen und eine Überanpassung zu verhindern. Die detaillierte Architektur der vorgeschlagenen neuronalen Netzwerkmodelle wird im Rest dieses Abschnitts vorgestellt.

Wir haben denselben 1D-CNN-Klassifikator angewendet, um die Wellenformen und Frequenzspektren der entrauschten Rückstreusignale der Zellen zu analysieren. Der 1D-CNN-Klassifikator bestand aus sieben erweiterten 1D-Faltungsschichten, drei vollständig verbundenen Schichten, sieben Dropout-Schichten und vier Max-Pooling-Schichten, wie in Abb. 3b dargestellt. Darüber hinaus führten wir eine Batch-Normalisierung für jede Faltungsschicht durch und L2-Regularisierung und Xavier-Normalinitialisierung52 wurden sowohl auf die Gewichte als auch auf die Vorspannungen der Faltungs- und vollständig verbundenen Schichten angewendet.

Bestehende Studien28 zu Methoden zur Erfassung rückgestreuter Signale von Zellen gehen davon aus, dass die Größe der Zellen/Partikel die Frequenzspektren der rückgestreuten Signale beeinflusst. Darüber hinaus setzt ein markierungsfreies Einzelzellanalysesystem, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, in sehr kurzer Zeit hochfrequente Ultraschall-Mikrostrahlen auf Zellen ein. Daher ist auch das von den Zellen zurückgestreute Signal im Vergleich zum gesamten Signal deutlich kurz, wie in Abb. 4 dargestellt. Wenn wir die Wellenform direkt analysieren, kann die Suche nach einem kurzen Zeitraum, einschließlich substantieller Signale von Zellen, eine zusätzliche Belastung darstellen. Bei der Frequenzspektrumanalyse haben wir diesen Punkt jedoch berücksichtigt. Daher erwarteten wir, die Frequenzspektrumanalyse mit höherer und stabilerer Genauigkeit durchzuführen als die Wellenformanalyse.

Mithilfe der schnellen Fourier-Transformation (FFT)53 extrahierten wir die Frequenzspektren der rückgestreuten Signale, die durch das vorgeschlagene Autoencoder-Modell entrauscht wurden. Für ein diskretes Signal \(\hat{X}(n)\), wobei \(n \in [0, N-1]\) und N die Anzahl der Abtastwerte ist, ist sein Frequenzspektrum \(\hat{X} (f)\) und FFT können wie folgt formuliert werden:

wobei \(i=\sqrt{-1}\) eine imaginäre Einheit ist und \(f \in [0, N-1]\)den Frequenzkomponenten entspricht. Somit gibt \(\hat{X}(f)\) die Amplitude der Frequenz f in \(\hat{X}(n)\) an. Da \(\hat{X}(f)\) eine symmetrische Funktion ist, verwenden wir nur deren rechte Hälfte.

Sowohl die Frequenz- als auch die Wellenformsignale waren sequentielle Daten. Wir konnten jedoch die gesamte Länge der Signale kontrollieren, die viel länger ist als die tatsächlich von den Zellen zurückgestreuten Signale, und spätere Proben oder Komponenten mit höherer Frequenz waren nicht signifikanter als frühere Proben oder Komponenten mit niedrigerer Frequenz. Daher haben wir lokale Merkmale von Signalen im Zeit- und Frequenzbereich mithilfe eines 1D-CNN anstelle eines RNN extrahiert, was zur Verflüchtigung früherer Eingaben führen kann. Die vollständig verbundenen Schichten wurden dann trainiert, um Unterschiede in den lokalen Merkmalen basierend auf den Zelltypen zu entdecken. Abbildung 3b zeigt die detaillierte Struktur des vorgeschlagenen 1D-CNN-Klassifikators. In dieser Studie haben wir das vorgeschlagene System bewertet, indem wir Krebszellen im Blut (PNT1A) von Erythrozyten unterschieden. Daher verwendeten wir die Sigmoidaktivierung auf der Ausgabeschicht und den binären Kreuzentropieverlust. Um die Robustheit des Systems gegenüber Rauschen weiter zu erhöhen und eine Überanpassung zu verhindern, haben wir wie beim vorgeschlagenen Autoencoder eine Datenerweiterung mithilfe von Gaußschen Rauschen durchgeführt. Für die Frequenzspektrumanalyse haben wir zunächst Gaußsches Rauschen injiziert und dann eine FFT durchgeführt. Sowohl für die Frequenzspektren als auch für die Wellenformsignale kann der 1D-CNN-Klassifikator wie folgt formuliert werden:

wobei \(Y_i\) und \(\hat{Y_i}\) die tatsächlichen bzw. vorhergesagten Zelltypen sind, die dem i-ten Eingangssignal \(X_i\), \(h_{1D}(\cdot.) entsprechen ;\cdot )\) stellt das vorgeschlagene 1D-CNN-Modell dar und \(W_c\) bezeichnet einen Parametersatz des Modells.

Die Amplituden der Frequenzkomponenten und zeitlichen Änderungen der Amplituden wurden in den Frequenzspektren bzw. Wellenformsignalen sichtbar. Mithilfe der Zeit-Frequenz-Domänentransformation können die Merkmale von Frequenz und Amplitude gleichzeitig analysiert werden. Wir gehen davon aus, dass diese als Spektrogramm bezeichnete Integration verschiedene Eigenschaften von Zellen besser beschreiben kann als 1D-Darstellungen. Das Spektrogramm stellt die Intensität der Signale in der Zeit-Frequenz-Ebene (2D-Raum) dar, wie in Abb. 4 dargestellt. Für die Transformation verwendeten wir eine Kurzzeit-Fourier-Transformation (STFT)54, die nacheinander eine FFT für einen Teil von a durchführt Signal über ein Schiebefenster mit fester Länge. Wenn die Fenstergröße l und die Schrittgröße d war, führten wir zunächst eine FFT für ein Signal \(\langle \hat{X}(0), \ldots , \hat{X}(l-1) \rangle\) durch. , und bei der nächsten Iteration bewegte sich das Fenster zu \(\langle \hat{X}(d), \ldots , \hat{X}(d+l-1) \rangle\) (in dieser Studie \(l =32\) und \(d=16\)). Folglich haben wir die Frequenzspektren für jedes Zeitfenster erhalten. Dies lässt sich wie folgt formulieren:

Dabei ist w(n) die Fensterfunktion und m die diskrete Frequenzvariable. Das Rohsignal wurde in neun Segmente mit \(50\%\) Überlappung unterteilt; Jedes Segment wurde mit einem Hamming-Fenster gefenstert und die Abtastrate betrug 1.000.000 Hz. Das Spektrogramm ist die quadrierte Größe der STFT.

Zhu et al.55 wandten ein 1D-CNN auf die Frequenzbereichsanalyse von Spektrogrammen und das lange Kurzzeitgedächtnis (LSTM) an, um zeitliche Änderungen in den Frequenzspektren zu analysieren. Dieser Faltungs-RNN-Ansatz bietet Vorteile bei der expliziten Darstellung der zeitlichen Eigenschaften von Daten. Die wiederkehrenden Schichten verursachen jedoch langfristige Abhängigkeitsprobleme. Daher haben wir in dieser Studie eine erweiterte 2D-Faltung auf die Spektrogramme angewendet, um die charakteristische lokale Struktur zu erfassen, in der sich der Zelltyp vom gesamten Signal unterscheidet.

Da wir das gleiche Problem der Klassifizierung von Zelltypen im Zeit-Frequenz-Bereich analysiert haben, wurde ein 2D-CNN-Modell erstellt, indem die Anzahl der Dimensionen in der Struktur des im vorherigen Abschnitt vorgestellten 1D-CNN-Modells erweitert wurde. Der Hauptunterschied zwischen dem 2D-CNN-Klassifikator und dem 1D-CNN besteht in der Anzahl der Parameter, die sich aus der erhöhten Anzahl von Dimensionen ergibt, während ihre Strukturen nahezu identisch sind.

Abbildung 3c zeigt die Architektur des vorgeschlagenen 2D-CNN-Klassifikators im Detail. Für die binäre Klassifizierung von Zelltypen sind die Aktivierungsfunktion auf der Ausgabeschicht und die Verlustfunktion die Sigmoidaktivierung bzw. der binäre Kreuzentropieverlust. Bevor wir den SFTF auf Rohsignale anwendeten, führten wir eine Datenerweiterung mit Gaußschen Rauschen durch, um die Robustheit des Klassifikators gegenüber Rauschen und Überanpassung zu verbessern, wie beim 1D-CNN-Klassifikator. Daher kann der 2D-CNN-Klassifikator für das Spektrogramm von Signalen auf ähnliche Weise wie in Gl. formuliert werden. (4).

Wir haben unsere Forschungsfragen validiert, indem wir das vorgeschlagene System zur Klassifizierung lebender Zellen (RBC und PNT1A) angewendet haben. Als Kombination bestehender Ultraschallgeräte (d. h. markierungsfreies Einzelzellanalysesystem) und herkömmlicher CNN-Modelle liegt die Bedeutung des vorgeschlagenen Systems in der Automatisierung der Zelltypklassifizierung durch Analyse der rückgestreuten Signale von Zellen. Daher haben wir zunächst die Unterscheidbarkeit der rückgestreuten Signale (RQ 1) validiert, indem wir untersucht haben, ob das vorgeschlagene System in der Lage ist, lebende Zellen von anderen Zellen oder Partikeln zu unterscheiden (Tabellen 1, 2, 3). Bei der Signalanalyse haben wir drei Ansätze (Wellenform-, Frequenzspektrum- und Spektrogrammanalyse) vorgestellt, die auf der Vorverarbeitung der Signale basieren. Diese Ansätze haben Vor- und Nachteile hinsichtlich der Rechenkomplexität der Vorverarbeitung und des Modelltrainings. Daher haben wir versucht zu überprüfen, ob zusätzliche Vorverarbeitung zur Leistung des gesamten Systems (RQ 2 und RQ 3) beiträgt. Diese Überprüfung ergab auch die Bedeutung der Frequenz- und Zeitbereichsmerkmale der von den Zellen zurückgestreuten Signale (Abb. 5). Darüber hinaus waren die gesammelten Signale, wie in Abb. 4 dargestellt, verrauscht und unser interessierender Zeitraum war ein deutlich kurzer Puls. Daher haben wir die Robustheit des vorgeschlagenen Systems gegenüber Rauschen und den Beitrag des vorgeschlagenen Autoencoders zur Systemleistung bewertet, indem wir Ablationstests für Entrauschungstechniken durchgeführt haben (Tabelle 4).

Leistungsbewertung des vorgeschlagenen Modells im Hinblick auf Genauigkeit (A), Präzision (P), Rückruf (R) und \(F_1\) Maß (\(F_1\)) als Funktion der Frequenzauflösung. Durchgezogene und gepunktete Linien zeigen die Ergebnisse des Signaltrainings im Frequenzspektrum (Freq) bzw. im Spektrogramm (Freq+Temp).

In diesem Abschnitt wird der Versuchsaufbau beschrieben, einschließlich der Datensätze, Bewertungsmetriken, Hyperparametereinstellungen und Basismethoden. Wir sammelten 77 Signale für jeden Zelltyp (12 RBC- und 12 PNT1A-Zellen) und 146 Signale für Polystyrol-Mikrokügelchen (72 Signale, die von 17 Mikrokügelchen mit 5 μm erhalten wurden, und 74 Signale, die von 14 Mikrokügelchen mit 10 μm gemessen wurden). upmu\)m). Der Mittelwert und die Standardabweichung der Größe von Erythrozyten- und PNT1A-Zellen betrugen 6,57 μm bzw. 10,10 μm 0,88 μm und 5 μm. \upmu\)m und 10 \(\upmu\)m Mikrokügelchen waren \(4,98 \pm 0,06\;\upmu\)m bzw. \(9,97 \pm 0,07\;\upmu\)m. Die rückgestreuten Signale einzelner Objekte wie Mikrokügelchen oder Zellen wurden im akustisch eingeschlossenen Zustand mittels Ultraschall gemessen. Da sie gleichzeitig eingefangen und gemessen wurden, konnte das Signal nur vom Zielobjekt und nicht von Informationen von den umgebenden Objekten erhalten werden, was der Hauptvorteil dieser Technologie sein könnte. Allerdings bereiten diese komplexen experimentellen Verfahren auch Schwierigkeiten bei der Gewinnung großer Datensätze. Ein kleiner Datensatz ist eine intrinsische Einschränkung des Bereichs der Einzelzellanalyse mit akustischen Pinzetten56,57,58,59,60,61,62, was zu Überanpassungsproblemen und der Datenzuverlässigkeit experimenteller Ergebnisse führen kann. Um mögliche Probleme anzugehen, führten wir zunächst eine dreifache Kreuzvalidierung durch, um zu untersuchen, ob das vorgeschlagene Modell mit der Vielfalt lebender Zellen umgehen kann. In jedem Experiment haben wir unseren Datensatz in drei gleiche Teile geteilt und dabei die Verteilungen der Markierungen (z. B. Zelltypen und Mikrosphären) beibehalten. Um sicherzustellen, dass jedes rückgestreute Signal mindestens einmal als Testprobe verwendet wurde, wurden in jedem Validierungsfall zwei der drei Teile des Datensatzes als Trainingsdaten und der verbleibende Teil als Testdaten verwendet. Anschließend haben wir den Datensatz durch die Injektion von Gauß'schem Zufallsrauschen erweitert. Wir haben für jedes ursprüngliche Rückstreusignal in den Trainingsdaten zehn verrauschte Signale generiert.

Wir haben vier Bewertungsmetriken verwendet: Genauigkeit (A), Präzision (P), Rückruf (R) und \(F_1\) Maß (\(F_1\)). Wenn T einen Satz automatisch erkannter PNT1A-Zellen angibt und sich \(T^*\) auf einen Satz tatsächlicher PNT1A-Zellen bezieht, kann die Genauigkeit wie folgt formuliert werden:

Dabei bezeichnet U die universelle Menge der Zellen in unserem Datensatz und \(|\cdot |\) die Anzahl der Elemente in der Menge.

Das Entrauschungs-Autoencoder-Modell und die Klassifikatoren wurden mit Keras in Python implementiert. Wir haben eine Rastersuche nach den Hyperparametern des vorgeschlagenen Entrauschungs-Autoencoders durchgeführt; die Anzahl der Epochen (\(\varepsilon\)): 100–300 mit einer Schrittweite von \(+50\), Lernrate (\(\rho\)): 0,0001–0,1 mit einer Schrittweite von \(\ mal 10\), Stapelgröße: 3–18 mit einer Schrittgröße von \(+3\), Merkmalsvektorgröße (Z): 625–2500 mit einer Schrittgröße von \(\times 2\) und Rauschfaktor ( \(\sigma _n\)): 0,1–0,5 mit einer Schrittweite von \(+0,1\). Das vorgeschlagene Modell erzielte die beste Leistung bei: \(\varepsilon\) von 200, \(\rho\) von 0,01, einer Stapelgröße von 12, einer Merkmalsvektorgröße (Z) von 1250 und \(\sigma _n\) von 0,1 . Wir haben auch nach Hyperparametern der STFT gesucht; die Fenstergröße (w): 8–64 mit einer Schrittgröße von \(\times 2\) und die Überlappungsgröße: 2–16 mit einer Schrittgröße von \(\times 2\). Basierend auf einer Rastersuche haben wir die Fenstergröße auf 32 und die Überlappungsgröße auf 16 ermittelt. Für die Klassifikatoren haben wir die maximale Pooling-Schicht mit einer Poolgröße von 2 und (2, 2) im 1D- bzw. 2D-CNN angewendet und die Abbrecherquoten wurden auf 0,2 festgelegt. Die Hyperparameter der vorgeschlagenen Klassifikatoren wurden wie folgt ausgewählt; \(\varepsilon\): 30–250 mit einer Schrittweite von \(+20\), \(\rho\): 0,0001–0,1 mit einer Schrittweite von \(\times 10\) und Chargengröße: 3 –18 mit einer Schrittweite von \(+3\). Das CNN-Modell hatte die beste Leistung bei: \(\rho\) von 0,001, einer Stapelgröße von 15 und \(\varepsilon\) von 50 sowohl für den 1D- als auch den 2D-CNN-Klassifikator.

Um die Notwendigkeit neuronaler Netzwerkmodelle zu demonstrieren, verglichen wir außerdem die Leistung der vorgeschlagenen Klassifikatoren mit der herkömmlicher ML-Algorithmen, einschließlich Support Vector Machine (SVM), logistischer Regression (Logit) und Multi-Layer-Perceptrons (MLP). Wir haben unter den linearen, polynomialen und radialen Basisfunktionskernen (RBF) nach dem optimalen SVM-Kernel gesucht, und der SVM-Klassifikator hatte mit dem linearen Kernel die beste Leistung. Wir haben den MLP-Klassifikator mit fünf versteckten Schichten mit 100 versteckten Einheiten und den ReLU-Aktivierungsfunktionen zusammengestellt. Die Sigmoidaktivierung wurde in der Ausgabeschicht dieses Modells verwendet und ihre Verlustfunktion war der binäre Kreuzentropieverlust. Die Parameter des MLP-Modells wurden wie bei den vorgeschlagenen Klassifikatoren mit der normalen Xaiver-Initialisierung52 bzw. dem Adam-Optimierer44 initialisiert und aktualisiert. Wir haben die Hyperparametersuche für das MLP-Modell auf die gleiche Weise wie die CNN-Klassifikatoren durchgeführt. Der MLP-Klassifikator erzielte die beste Leistung bei: \(\rho\) von 0,001, einer Chargengröße von 12 und \(\varepsilon\) von 100.

Wir untersuchten anhand der folgenden Experimente, ob das vorgeschlagene System Zellen angemessen und effektiv von anderen Objekten im Mikrometerbereich unterscheiden kann: (1) Klassifizierung von Zelltypen mit unterschiedlichen Durchmessern (z. B. Erythrozyten und PNT1A-Zellen), (2) Unterscheidung von Polystyrol-Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Durchmessern Durchmesser (z. B. 5 \(\upmu\)m und 10 \(\upmu\)m) und (3) Klassifizierung mikrometergroßer Objekte mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften und ähnlichen Durchmessern (z. B. 5 \(\upmu\)m Mikrosphären mit Erythrozyten und 10 \(\upmu\)m Mikrosphären mit PNT1A-Zellen). Experimentelle Ergebnisse enthüllten die Eigenschaften von Zellen, die sich in den Mustern ihrer rückgestreuten Signale widerspiegelten.

Wir haben RQ 1 auf der Grundlage der Wirksamkeit der vorgeschlagenen Modelle auf die Einzigartigkeit der rückgestreuten Signale von Zellen validiert. Wir haben versucht, PNT1A-Zellen von RBC mithilfe der vorgeschlagenen CNN-Klassifikatoren zu unterscheiden. Wenn rückgestreute Signale signifikante Eigenschaften von Zellen wie Größe und Strukturmaterial widerspiegeln, sind die Klassifikatoren sehr genau und umgekehrt. Tabelle 1 listet die experimentellen Ergebnisse auf.

Wie im oberen Teil von Tabelle 1 beschrieben, zeigte die Zeit-Frequenz-Domänenanalyse unter den drei Klassifikatoren sowohl hinsichtlich der durchschnittlichen Genauigkeit als auch der Varianz die beste Leistung. Sowohl die Frequenzbereichs- als auch die Zeit-Frequenzbereichsanalyse zeigten perfekte Genauigkeit bei der zweiten und dritten Faltung. Umgekehrt hatte der Frequenzbereich eine etwas geringere Genauigkeit als die anderen Domänen auf der ersten Falte. Im Vergleich zu den beiden anderen Klassifikatoren wies der vorgeschlagene Klassifikator für Wellenformsignale eine etwas geringere, aber ähnliche Genauigkeit bei der ersten und zweiten Faltung auf. Die Zeitbereichsanalyse zeigte jedoch eine geringe Leistung im dritten Bereich, sogar niedriger als die herkömmlicher ML-Methoden. Wir gingen davon aus, dass die Testdaten der dritten Falte möglicherweise Signale enthalten, die nur anhand von Frequenzbereichsmerkmalen unterscheidbar sind. Darüber hinaus waren die Frequenzbereichsmerkmale gegenüber ungewöhnlichen Proben robuster als die Wellenform. Dennoch erreichten die vorgeschlagenen Klassifikatoren im Durchschnitt eine hohe Klassifizierungsgenauigkeit (\(\ge 0,88\)), unabhängig von den Datendarstellungen und Genauigkeitsmetriken. Daher deuten die experimentellen Ergebnisse darauf hin, dass die Muster rückgestreuter Signale ein wirksames Merkmal zur Unterscheidung bestimmter Zelltypen sein können (RQ 1).

Darüber hinaus haben wir die Notwendigkeit von Deep-Learning-gestützten Modellen validiert, indem wir die vorgeschlagenen Klassifikatoren mit herkömmlichen ML-Methoden verglichen haben, wie im unteren Teil von Tabelle 1 dargestellt. Wir haben die gleichen Vorverarbeitungsmethoden, einschließlich Rauschunterdrückung und Erweiterung, mit den vorgeschlagenen Klassifikatoren auf die angewendet Vergleichsgruppe für einen fairen Vergleich. Die vorgeschlagenen Klassifikatoren übertrafen die Basismethoden und ihre Leistungsverbesserung war in den Zeit- und Frequenzbereichsanalysen deutlicher als im Zeit-Frequenzbereich. Wir gingen davon aus, dass die Kombination der Zeit- und Frequenzbereichsmerkmale den Klassifikatoren umfangreichere Informationen für Zellen liefern könnte. Dennoch deutet die deutliche Verbesserung darauf hin, dass die Zelleigenschaften in rückgestreuten Signalen mit herkömmlichen Methoden schwer zu ermitteln sind und die Analysefähigkeiten der CNN-Modelle erforderlich sind. Während der Hyperparametersuche hatte SVM mit dem linearen Kernel eine etwas höhere Genauigkeit (\(\le 0,02\) in Bezug auf das \(F_1\)-Maß) als mit den anderen nichtlinearen Kerneln. Dieser Punkt kann im Gegensatz dazu gesehen werden, dass die vorgeschlagenen CNN-Klassifikatoren, bei denen es sich um nichtlineare Modelle handelt, SVM mit dem linearen Kernel deutlich übertrafen. Angesichts des geringen Leistungsunterschieds zwischen SVM-Kerneln und der Unterschiede in ihren Modellarchitekturen könnte die höhere Modellkomplexität der CNN-Klassifizierer sie jedoch dazu befähigen, komplizierte Korrelationen von Signalmerkmalen mit Zelleigenschaften besser auszudrücken als SVM. Wir können ein ähnliches Ergebnis finden, da SVM sowohl die logistische Regression als auch MLP, die nicht linear sind, nicht durchweg über- oder unterbot. Daher gehen wir davon aus, dass die (Nicht-)Linearität der Modelle weniger Einfluss auf ihre Wirksamkeit bei der Analyse rückgestreuter Signale hatte als ihre Architekturen. MLP übertraf andere Basismethoden wie SVM und logistische Regression bei Wellenform- und Frequenzspektren. Allerdings schnitt MLP bei den Spektrogrammen deutlich ab, was zeigt, dass MLP möglicherweise nicht für die Analyse sequenzieller Merkmale wie dynamischer Änderungen in den Frequenzspektren geeignet ist.

Als nächstes wurde das vorgeschlagene Modell verwendet, um zwei unterschiedlich große Polystyrol-Mikrokügelchen (Durchmesser von 5 und 10 \(\upmu\)m) zu klassifizieren, um sich auf die Auswirkung von Größenunterschieden zu konzentrieren, indem die Möglichkeit struktureller Materialunterschiede ausgeschlossen wird.

Ein früheres Experiment zeigte, dass das vorgeschlagene System Zellen mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften, einschließlich Größe und Strukturmaterial, unterscheiden kann. Als nächstes konzentrierten wir uns auf die Auswirkung von Größenunterschieden, indem wir die Möglichkeit struktureller Materialunterschiede ausschlossen. Wir haben das vorgeschlagene System auf Polystyrol-Mikrokugeln unterschiedlicher Größe und desselben Strukturmaterials angewendet. Das System klassifizierte zwei Arten von Polystyrol-Mikrokügelchen anhand ihrer Größe (5 und 10 µm) durch Analyse ihrer rückgestreuten Signalmuster. Tabelle 2 zeigt die Klassifizierungsgenauigkeit der vorgeschlagenen Modelle für Polystyrol-Mikrokugeln.

Die vorgeschlagenen Modelle zeigten eine hohe Genauigkeit und geringe Varianz bei der Klassifizierung von Polystyrol-Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit unserer vorherigen Studie28 und untermauert, dass die Durchmesser von Objekten im Mikrometerbereich die Muster der rückgestreuten Signale beeinflussen. Allerdings unterschieden sich auch die Ergebnisse für Polystyrol-Mikrokügelchen von den experimentellen Ergebnissen für Zellen. Bei der Zellklassifizierung übertraf die Frequenzspektrumanalyse die Wellenformanalyse, und zeitliche Änderungen in den Frequenzspektren trugen zur Klassifizierungsgenauigkeit bei. Allerdings übertrafen die Wellenform- und Frequenzspektrumanalysen die Spektrogrammanalyse bei der Mikrosphärenklassifizierung. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Wellenformsignale und Frequenzspektren ausreichende Merkmale zur Bestimmung der Größenunterschiede bei Objekten im Mikrometerbereich enthalten. Darüber hinaus können wir davon ausgehen, dass Merkmale in den zeitlichen Änderungen in den Frequenzspektren für die Größenklassifizierung übermäßig häufig sind. Grundsätzlich enthalten Muster rückgestreuter Signale vielfältigere Eigenschaften von Zellen als nur Zelldurchmesser (z. B. Strukturmaterial und Eigenschaften von Zellmembranen), und Spektrogramme könnten diese Eigenschaften darstellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Spektrogrammanalyse notwendig ist, um rückgestreute Muster für abstraktere automatisierte Diagnoseaufgaben zu nutzen.

Wir haben untersucht, ob das vorgeschlagene System Zellen von Polystyrol-Mikrokügelchen ähnlicher Größe unterscheiden kann, um noch einen Schritt weiter zu gehen. Da ein früheres Experiment zeigte, dass rückgestreute Signale den Größenunterschied widerspiegeln, untersuchte dieses Experiment die Auswirkung struktureller Materialunterschiede, indem die Möglichkeit des Größenunterschieds ausgeschlossen wurde. Wir haben versucht, PNT1A-Zellen (\(10,10 \pm 0,88\;\upmu\)m) von 10 \(\upmu\)m Mikrosphären (\(9,97 \pm 0,07\;\upmu\)m) und Erythrozyten (\(\upmu\)m) zu unterscheiden. (6,57 \pm 0,66\;\upmu\)m) aus 5 \(\upmu\)m Mikrokügelchen (\(4,98 \pm 0,06\;\upmu\)m) unter Verwendung des vorgeschlagenen Systems. Tabelle 3 zeigt die Genauigkeit der beiden Klassifizierungsaufgaben.

Die vorgeschlagenen Klassifikatoren unterschieden RBC genau von 5 μm großen Mikrokügelchen und zeigten gleichzeitig eine hohe Varianz für PNT1A und 10 μm große Mikrokügelchen, wie in Tabelle 3 zusammengefasst. Dieses Ergebnis könnte teilweise auf die Größe zurückgeführt werden Die Unterschiede zwischen Erythrozyten und 5 µm großen Mikrosphären waren signifikanter als die zwischen PNT1A-Zellen und 10 µm großen Mikrosphären. Darüber hinaus könnte unser Datensatz, der relativ klein skaliert war, für die Klassifikatoren nicht ausreichen, um die strukturellen Materialunterschiede zwischen PNT1A-Zellen und 10 µm großen Mikrokügelchen zu verstehen, die sich in ihren rückgestreuten Signalen widerspiegeln. In zukünftigen Forschungen werden wir versuchen, den Umfang und Umfang dieses Datensatzes zu erweitern. Trotz der hohen Varianz zeigten die vorgeschlagenen Klassifikatoren jedoch eine perfekte Genauigkeit beim Nachweis von PNT1A, und zwar um das Zweifache unter den drei. Daher können wir davon ausgehen, dass die Klassifikatoren die strukturellen Materialunterschiede von Objekten im Mikrometerbereich und Größenunterschiede erfassen können. Darüber hinaus übertraf die Spektrogrammanalyse in diesem Experiment die anderen Fälle deutlich, wohingegen sowohl die Spektrum- als auch die Spektrogrammanalyse im ersten Experiment eine einwandfreie Leistung zeigten (Tabelle 1). Zeitliche Änderungen in den Frequenzspektren könnten umfassendere Informationen über das Strukturmaterial von Zellen (und Mikrosphären) darstellen als statische Frequenzspektren oder Wellenformsignale.

In diesem Abschnitt wird die Wirksamkeit des Frequenzspektrums und seiner zeitlichen Änderungen für die Zellcharakteristikanalyse (RQ 2 und RQ 3) validiert. Wie in Tabelle 1 aufgeführt, konnten sowohl die Frequenzspektrum- als auch die Spektrogrammanalyse die beiden Zelltypen mit hoher durchschnittlicher Genauigkeit und geringer Varianz voneinander unterscheiden. Grundsätzlich zeigen Frequenzbereichsmerkmale die Zelleigenschaften, die durch rückgestreute Signale hervorgerufen werden, effektiver auf als Zeitbereichsmerkmale. Darüber hinaus zeigt Tabelle 3, dass die Zeit-Frequenz-Domänenmerkmale nützlicher waren als die anderen beiden Datendarstellungen. Diese Ergebnisse waren die gleichen wie bei den herkömmlichen ML-Methoden (unterer Teil von Tabelle 1). Allerdings haben wir die Frequenzauflösung der Spektrogrammanalyse durch Unterabtastung in den obigen Experimenten von 5000 auf 513 verringert, um der zeitlichen und räumlichen Komplexität Rechnung zu tragen. Gleichzeitig haben wir die Frequenzauflösung der Spektrumanalyse bei 5000 belassen. Daher sind die bisherigen experimentellen Ergebnisse nicht ausreichend, um RQ 3 zu unterstützen. Um dieses Problem anzugehen, haben wir die Genauigkeit von Spektrum- und Spektrogrammanalysen basierend auf einer Frequenzauflösung von 125–2000 untersucht mit einer Schrittweite von \(+ 125\). Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse des Experiments.

Wie in Abb. 5 dargestellt, zeigte die Spektrogrammanalyse unabhängig von der Frequenzauflösung eine konsistente und hohe Genauigkeit und übertraf die Frequenzspektrumanalyse. Im Gegensatz dazu zeigte die Durchführung der Frequenzspektrumanalyse eine instabile Tendenz. Das Maß \(F_1\) für die Frequenzspektrumanalyse lag unter 0,70, bis die Frequenzauflösung 1750 betrug. Insbesondere war seine Präzision weitaus strenger als sein Rückruf. Wenn die Auflösung der Frequenzspektren weniger als 2000 betrug, verschwanden die durch die Rückstreusignale reflektierten Zelleigenschaften. In diesem Fall deuten die vorherigen experimentellen Ergebnisse in den Tabellen 1, 2 und 3 darauf hin, dass die zeitliche Analyse von Frequenzspektren bestimmte Aspekte der Zelleigenschaften entdeckte, die sich von der statischen Analyse unterscheiden. Darüber hinaus macht die Reduzierung der Frequenzauflösung die zeitliche Analyse rechnerisch effizienter als die statische Analyse.

Wir haben einen Ablationstest für die im vorgeschlagenen System verwendeten Rauschunterdrückungsmethoden durchgeführt. Die bemerkenswerte Leistung des vorgeschlagenen Systems kann zu dem Missverständnis führen, dass die vorgeschlagenen CNN-Modelle überfordert sind und die herkömmlichen Funktionen möglicherweise zur Zellklassifizierung geeignet sind. Allerdings sind die rückgestreuten Signale von Zellen extrem verrauscht, und die Extraktion wesentlicher Merkmale unter Rauschen ist mit herkömmlichen Heuristiken schwieriger. Wir haben versucht, dies durch einen Ablationstest für den Entrauschungs-Autoencoder und die Gaußsche Rauschinjektion zu demonstrieren. Wir haben die Leistung des vorgeschlagenen Systems, das die vorgeschlagenen Entrauschungsmethoden (DN+) zur Klassifizierung von Erythrozyten und PNT1A-Zellen verwendet, mit einem Fall verglichen, bei dem nur der Entrauschungs-Autoencoder (DN) verwendet wurde, und einem anderen Fall ohne Entrauschungstechnik (Raw). Tabelle 4 zeigt die experimentellen Ergebnisse der Beiträge der vorgeschlagenen Entrauschungsmethoden zur Genauigkeit unseres automatisierten Zelltyp-Klassifizierungssystems.

Wie in Tabelle 4 aufgeführt, zeigten die drei Fälle ähnliche Genauigkeiten bei der Wellenform- und Spektrogrammanalyse. Allerdings übertraf DN+ die beiden anderen Fälle in der Frequenzspektrumanalyse deutlich. Dieses Ergebnis zeigt, dass unsere Rauschunterdrückungsmethoden die Frequenzbereichsmerkmale der von den Zellen rückgestreuten Signale effektiv wiederherstellen. Dennoch könnte der vorgeschlagene Entrauschungs-Autoencoder ohne Gaußsche Rauschinjektion nicht zur Klassifizierungsgenauigkeit beitragen. Durch die Datenerweiterung mithilfe der Gaußschen Rauschinjektion konnten die vorgeschlagenen Autoencoder und Klassifikatoren trainiert werden, um signifikante Signalmerkmale von Rauschen zu unterscheiden. Darüber hinaus wurden alle drei Klassifikatoren mit der gleichen Datenerweiterungsmethode trainiert (nicht nur im Entrauschungsschritt), aber das Rauschen wirkte sich nur auf die Frequenzspektrumanalyse aus. Daher können wir vermuten, dass die zeitlichen Merkmale rückgestreuter Signale robuster gegenüber Rauschen sind als die Merkmale im Frequenzbereich.

Ziel dieser Studie war es, lebende Zellen automatisch anhand der Zelltypen zu klassifizieren, indem die Muster der zurückgestreuten Signale der Zellen analysiert wurden. In einer früheren Studie28 wurde die markierungsfreie akustische Sensortechnik angewendet, um die Größenunterschiede zwischen Erythrozyten und PNT1A-Krebszellen zu bestimmen, indem die IB-Koeffizienten der rückgestreuten Signale mit manueller Nachbearbeitung gemessen wurden. Durch die automatische Analyse der Muster der zurückgestreuten Signale konnten wir jedoch zeitaufwändige Prozesse und mögliche Fehler durch manuelle Analysen vermeiden. Diese Studie demonstrierte ein neuartiges automatisiertes Zelltyp-Klassifizierungssystem durch die Kombination der markierungsfreien akustischen Erfassung eines gefangenen einzelnen Objekts28 mit einem 1D-Faltungs-Autoencoder und CNN-Klassifikatoren. Die Experimente und Forschungsfragen sollten die Wirksamkeit jedes Moduls des vorgeschlagenen Systems validieren. Zunächst haben wir die Wirksamkeit der Muster rückgestreuter Signale zur Klassifizierung von Zelltypen überprüft, indem wir das vorgeschlagene System auf zwei Zelltypen (RBC und PNT1A) und zwei Arten von Polystyrol-Mikrokügelchen (5 und 10 \(\upmu\)m) angewendet haben. Mithilfe von Zellen und Mikrokügelchen führten wir drei Experimente durch, um Folgendes zu identifizieren: (1) Erythrozyten und Krebszellen, (2) Polystyrol-Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe und (3) Zellen und Polystyrol-Mikrokügelchen ähnlicher Größe. Wir haben auch die drei Vorverarbeitungsmethoden verglichen, um zu untersuchen, ob die Arten von Merkmalen in rückgestreuten Signalen (z. B. Zeit- und Frequenzbereiche) mit den physikalischen Eigenschaften von Objekten im Mikrometerbereich korrelieren. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die zurückgestreuten Signalmuster Zelldurchmesser und andere physikalische Eigenschaften widerspiegeln, wie z. B. strukturelle Materialunterschiede, was zeigt, wie wichtig es ist, ihren Zusammenhang mit grundlegenden molekularen, architektonischen und Verhaltensänderungen im Zusammenhang mit Zellzustand und Krankheitsprozessen zu verstehen63,64. Folglich waren sowohl Zeit- als auch Frequenzbereichsmerkmale für die Analyse der Zelleigenschaften von Bedeutung. In Bezug auf ML-Modelle wurde die Notwendigkeit der CNN-Klassifikatoren durch einen Vergleich ihrer Leistung mit herkömmlichen ML-Modellen nachgewiesen und die Wirksamkeit des Entrauschungs-Autoencoders anhand von Ablationstests validiert.

In den Tabellen 1 und 2 könnte der Größenunterschied einer der wesentlichen Faktoren sein, die die Muster der von Partikeln oder Zellen zurückgestreuten Signale beeinflussen. Folglich kamen wir zu einer Schlussfolgerung, die mit einer früheren Studie übereinstimmt28. Wie in Tabelle 3 zusammengefasst, zeigte das vorgeschlagene System jedoch eine hohe Genauigkeit bei der Unterscheidung von Zellen von Polystyrol-Mikrokügelchen ähnlicher Größe. Dieses Ergebnis zeigt, dass die physikalischen Eigenschaften des Strukturmaterials auch die Muster der rückgestreuten Signale beeinflussen, nicht nur die Größen. Das vorgeschlagene System unterschied Erythrozyten genau von 5 μm großen Mikrokügelchen, trotz der hohen Varianz bei der Klassifizierung von PNT1A und 10 μm großen Mikrokügelchen. Dieses Ergebnis kann auf Größenunterschiede sowie auf das Strukturmaterial zurückzuführen sein. Obwohl der Größenunterschied zwischen Erythrozyten und Mikrokügelchen mit 5 μm etwas größer war als der Unterschied zwischen PNT1A-Zellen und Mikrokügelchen mit 10 μm, könnte der Unterschied in der Mikrostruktur zusammen mit der Zellmechanik als sekundärer Faktor eine Rolle spielen . Frühere Studien haben gezeigt, dass der Zellkern bei einem dicht gepackten Objekt im Vergleich zum umgebenden Zytoplasma am steifsten ist oder sogar größer als der durchschnittliche Durchmesser der Erythrozyten. Im reifen Zustand haben Erythrozyten bei Säugetieren dagegen keinen Zellkern68 und können leicht verformt werden, um sich effizient durch die Kapillaren zu bewegen69. Darüber hinaus haben Zellkerne in der Optik einen anderen Brechungsindex und eine andere Massendichte als das Zytoplasma70,71. Daher können solche Unterschiede in der Mikrostruktur zusammen mit der Zellmechanik an der hohen Varianz bei der Klassifizierung von PNT1A-Zellen und 10 μm-Mikrokügelchen im Vergleich zu Erythrozyten und 5 μm-Mikrokügelchen beteiligt sein, dies wird jedoch intensiv sein künftig mit großen Datensätzen erforscht werden.

Das vorgeschlagene System zeigte eine ausgezeichnete Genauigkeit für die Zellklassifizierung, während die herkömmlichen Methoden eine geringe Genauigkeit zeigten, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von Deep-Learning-gestützten Modellen überstrapaziert werden kann, und ein gut konzipiertes System mit herkömmlichen Methoden kann dies tun eine vergleichbare Leistung erzielen. Nachfolgende Experimente (Abb. 5 und Tabelle 4) zeigten jedoch, dass das vorgeschlagene System (insbesondere im Fall der Spektrogrammanalyse) die niedrige Frequenzauflösung und das Fehlen von Rauschunterdrückung überwinden kann. Da die von den Zellen rückgestreuten Signale winzig klein waren und unerwünschtes Rauschen aufwiesen, ist es schwer zu erwarten, dass herkömmliche ML-Algorithmen und heuristikbasierte manuelle Methoden wesentliche Merkmale im Zusammenhang mit Zelleigenschaften zwischen Rauschen und unbedeutenden Reflexionen entdecken können. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Kombination von Merkmalen im Zeit- und Frequenzbereich die Genauigkeit der Erkennung von Zelleigenschaften, die Robustheit gegenüber Rauschen und die Auflösungsreduzierung verbessert. Grundsätzlich könnten zeitliche Änderungen in Frequenzspektren umfangreichere und eindeutigere Informationen über die physikalischen Eigenschaften von Zellen, einschließlich Größe und Strukturmaterial, enthalten als statische Frequenzspektren oder Wellenformsignale.

Das vorgeschlagene System kann im Vergleich zur vorherigen Studie28 lebende Zellen ohne manuelle Nachbearbeitung genau klassifizieren. Dennoch weist das vorgeschlagene System einige Einschränkungen auf, die in zukünftigen Forschungen berücksichtigt werden sollten. Zunächst wurden unsere Experimente mit zwei Arten von Zellen (RBC und PNT1A) und zwei Arten von Mikrokügelchen (5 und 10 \(\upmu\)m) durchgeführt. Obwohl wir gezeigt haben, dass unser System durch die Klassifizierung von Zellen und Mikrosphären mit ähnlicher Größe verschiedene Zelleigenschaften (nicht nur Durchmesser) berücksichtigen kann, sollten weitere Untersuchungen weitere Zelltypen mit unterschiedlichen Größen untersuchen, um diese Annahme zu bestätigen. Auch die Anzahl der Zellen und rückgestreuten Signale soll erhöht werden. In dieser Studie haben wir 154 Signale von 24 Zellen und 146 Signale von 31 Polystyrol-Mikrokügelchen gesammelt. Obwohl die Ergebnisse der Kreuzvalidierung zeigten, dass die hohe Genauigkeit des vorgeschlagenen Systems nicht auf eine Überanpassung zurückzuführen war, reichte die Anzahl der Zellen und Proben nicht aus, um die Vielfalt lebender Zellen darzustellen. Durch die Erweiterung des Datensatzes wird sich unsere zukünftige Forschung auf die Entdeckung von Zusammenhängen zwischen physikalischen und funktionellen Zelleigenschaften sowie Mustern rückgestreuter Signale von Zellen konzentrieren. Entdeckte Zusammenhänge können aufgeklärt und anschließend in die klinische Medizin übertragen werden, wobei es um den Krankheitsverlauf und das Ansprechen auf die Behandlung geht.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Steelman, ZA, Eldridge, WJ, Weintraub, JB & Wax, A. Ist der nukleare Brechungsindex niedriger als der des Zytoplasmas? Validierung von Phasenmessungen und Implikationen für Lichtstreuungstechnologien. J. Biophotonics 10, 1714–1722. https://doi.org/10.1002/jbio.201600314 (2017).

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Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health im Rahmen der Grant-Nr. unterstützt. P41-EB002182 (KKS), teilweise von der National Research Foundation of Korea (NRF) Von der koreanischen Regierung finanzierter Zuschuss (MSIT) (Nr. 2022R1F1A1065516) (O.-JL), teilweise von der National Research Foundation of Korea ( NRF) Zuschuss finanziert von der koreanischen Regierung (MSIT) (Nr. 2022R1A5A8023404) (HGL) und teilweise durch das F&E-Projekt „Development of a Next-Generation Data Assimilation System by the Korea Institute of Atmospheric Prediction System (KIAPS)“ gefördert von der Korea Meteorological Administration (KMA2020-02211) (H.-JJ).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hyeon-Ju Jeon und Hae Gyun Lim.

Data Assimilation Group, Korea Institute of Atmospheric Prediction Systems, Seoul, 07071, Republik Korea

Hyeon-Ju Jeon

Abteilung für Biomedizintechnik, Pukyong National University, Busan, 48513, Republik Korea

Hae Gyun Lim

Abteilung für Biomedizinische Technik, University of Southern California, Los Angeles, CA, 90089, USA

K. Kirk Shung & Min Gon Kim

Abteilung für Künstliche Intelligenz, Katholische Universität Korea, Bucheon, 14662, Republik Korea

O-Joun Lee

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MGK, O.-JL und HGL hatten die Idee. MGK und KKS haben die Ultraschallexperimente entworfen und durchgeführt. H.-JJ und O.-JL analysierten die Daten. O.-JL, HGL und MGK interpretierten die Daten. H.-JJ und MGK haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren überprüften die Ergebnisse und genehmigten die endgültige Version des Manuskripts.

Korrespondenz mit O-Joun Lee oder Min Gon Kim.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jeon, HJ., Lim, HG, Shung, KK et al. Automatisierte Zelltypklassifizierung, die erweiterte Faltungs-Neuronale Netze mit markierungsfreier akustischer Erfassung kombiniert. Sci Rep 12, 19873 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22075-6

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Eingegangen: 17. Mai 2022

Angenommen: 10. Oktober 2022

Veröffentlicht: 18. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22075-6

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